Поиск штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди почвенных микроорганизмов

Категория: Методы исследования

Просмотров: 6888

Возникновение генетической Инженерии и ее успехи в значительной мере связаны с открытием эндонуклеаз рестрикции [1], Эти ферменты широко используются в решении прикладных задач и служат объектом фундаментальных исследований, касающихся белок-нуклеиновых взаимодействий [1—3]. Наряду с этим, актуальным является изучение биосинтеза рестриктаз [4].
Целью данной работы явилось выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди почвенных микроорганизмов, а также оптимизация культивирования одного из них.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделенные из почвы штаммы расчищали на твердых агаризованных средах.
Идентификацию проводили общепринятыми тестами [5] и руководствуясь [6].
Использовали следующие компоненты сред и химические реактивы: СПА (г. Махачкала); трис, ЭДТА, лизоцим, тритон Х-100, бромистый этидий ("Serva", ФРГ); агарозу ("Sigma", США); ДНК фага λ (НПО "Фермент", г. Вильнюс); 2-меркаптоэтанол ("Calbiochem", США), триптон и дрожжевой экстракт фирмы "Difco" (США). Все остальные реактивы были отечественного производства марки х.ч. и о.с.ч.
Культивирование бактерий проводили в ферментере "Ultraferm" (LKB, Швеция) в полупериодическом режиме с подачей атмосферного воздуха 2 об/мин при 200 об/мин мешалки.
Анализ рестриктазной активности проводили следующим образом [7]. Колонию бактерий бактериологической петлей ресуспендировали в лизирующем буфере, содержавшем 0.1 М Трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 5x10^-3 М ЭДТА, 0.1 мг/мл лизоцима и 0.1 % тритона Х-100. Инкубацию вели при комнатной температуре до появления вязкости при постоянном встряхивании. Затем инкубационную смесь центрифугировали 2 мин в настольной центрифуге "Eppendorf" и супернатант анализировали на наличие ферментативной активности.

Определение активности рестриктаз

К 30 мкл реакционной смеси, содержавшей 1 мкг ДНК фага λ CI 857, 0.02 М Трис-HCl, рН 7.5, 0.01 М MgCl₂, 0. 02 М NaCl, добавляли 1-3 мкл осветленного лизата клеток. Инкубацию вели при 37°С. Продукты гидролиза фаговой ДНК анализировали горизонтальным электрофорезом в 1%-ной агарозе в трис-ацетатном буфере, рН 8.0 (0.5 М трис, 0.2 М ацетат натрия, 0.02 М ЭДТА). Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (5 мкг/мл) и фотографировали на пленку Микра.т-300 через красный светофильтр.
При препаративном выделении биомассу, ресуспендированную в калийфосфатном буфере, обрабатывали ультразвуком в дезинтеграторе "MSE" (США) в течение 40 с (мощность 200 Вт, частота 20 кГц, амплитуда 14 мкм) и охлаждали в ледяной бане. Цикл озвучивания и охлаждения повторяли 3-4 раза. Перед последним озвучиванием в суспензию добавляли 0.2 мл 10%-ного раствора тритон Х-100. Клеточный дебрис отделяли центрифугированием.
Хроматографическую очистку проводили по методике, предложенной Грин с соавт. [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Отправным моментом данной работы явилось использование ранее разработанной в нашей лаборатории методики анализа бактериальных штаммов на наличие рестриктаз (см. Экспериментальная часть).
При тестировании почвенных штаммов в трех из них обнаружили рестриктазы. Идентификация позволила отнести изучаемые микроорганизмы к видам Bacillus subtilis, Aeromonas punctata, Bacillus megaterium. Выделенные из этих штаммов ферменты были изошизомерами рестриктаз СlаI и Sau3АI, причем Bacillus subtilis, Aeromonas punctata синтезировали одну и ту же эндонуклеазу рестрикции - изошизомер фермента СlаI.
Отобранные продуценты различались как по выходу фермента, так и по степени загрязнения неспецифическими нуклеазами, которые маскировали активность соответствующей рестриктазы.
Наиболее активным оказался штамм Bacillus subtilis 15, поэтому он был выбран для последующей работы.
Эндонуклеаза рестрикции, продуцируемая этим штаммом и названная согласно общепринятой терминологии Bsu15I [9], узнает последовательность нуклеотидов 5'-ATCGAT-3' и находит широкое применение в генно-инженерных экспериментах.
При препаративном выделении рестриктазы было установлено, что наиболее полный выход фермента наблюдается при ультразвуковой дезинтеграции клеток с добавлением тритона Х-100 [10].
Известно, что важным фактором, влияющим на синтез ферментов различными микроорганизмами, являются условия культивирования [11]. Однако работы по влиянию состава питательной среды и режима культивирования на выход рестриктаз немногочисленны и стали появляться лишь в последнее время [4, 12]. Необходимость же таких исследований связана с промышленным масштабом производства эндонуклеаз рестрикции.
Поскольку не существует общей теории биосинтеза ферментов такого типа, в каждом конкретном случае задача повышения выхода решается эмпирически путем подбора условий в предварительных опытах.
Изучение влияния различных сахаров на выход рестриктазы Bsu15I обусловлено тем, что в ряде случаев быстроутилизируемая глюкоза, обеспечивающая активное накопление биомассы, ингибирует синтез биологически активных веществ (например, антибиотиков и некоторых ферментов) [11]. Ниже показано влияние 1% добавок сахаров к среде М9 на выход рестриктазы Bsu15I.

Приблизительно одинаковая активность наблюдается при использовании глюкозы, лактозы и сахарозы в качестве единственного источника
углерода для культивирования Bacillus subtilis 15 в минимальной среде. Однако наибольшим урожай биомассы был при добавлении глюкозы,
В крупномасштабных ферментациях предпочтительно использовать комплексные среды. Для Bacillus subtilis 15 в этом случае увеличивались как урожай биомассы, так и выход фермента, который в ряде опытов превышал значение 300 тыс. е.а./г. Следует отметить, что добавки в комплексные среды глюкозы в диапазоне концентраций от 0.5 до 1.5% не изменяли выход эндонуклеазы. В своих исследованиях для выращивания штамма мы использовали L-среду [13].
Влияние температуры на выход рестриктазы представлено на рис. 1. Максимальная активность Bsu15I наблюдается при температуре 23-28°С.

Рис. 1 Зависимость относительного выхода рестриктазы от температуры культивирования

Повышение концентрации соли в ряде случаев приводит к стимуляции биосинтеза рестриктаз. Для определения оптимальных значений концентраций NaCl В. Subtilis 15 выращивали в L-среде со следующими концентрациями соли (М): 0.04; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4. В качестве контроля была взята бессолевая L-среда. Относительное влияние концентрации NaCl представлено на рис. 2. Максимальная активность отмечается при 0.3-0.4 М NaCl. Необходимо отметить, что увеличение концентрации соли выше 0.4 М приводит к ингибированию роста культуры.

Рис. 2 Зависимость относительного выхода рестриктазы от концентраций хлористого натрия в L-среде

Подбор оптимальной питательной среды проводили с учетом динамики накопления биомассы и рестриктазной активности при глубинном культивировании В. Subtilis 15. Зависимость представлена на рис. 3. Из рисунка видно, что фаза замедленного роста является наиболее продуктивной по рестриктазе. Усиление аэрации среды также повышает выход рестриктазы.

Рис. 3 Динамика накопления биомассы и рестриктазной активности при культивировании B. subtilis 15. 1 - Биомасса (О.П.); 2 - рестриктазная активность (е.а./л)

В результате данной работы показана перспективность поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди почвенных микроорганизмов.
Удалось выявить и идентифицировать штаммы-продуценты изошизомеров ClaI и Sau3АI.
Изучено влияние различных пищевых добавок и условий культивирования на выход рестриктазы Bsu15I.
Выражаем искреннюю признательность К. А. Бендукидзе за помощь в идентификации микроорганизма Aeromonas punctuate и Э. Г. Малыгину за постоянную помощь и поддержку данной работы, а также благодарим Г. Е. Акулинина и Я. И. Речкунову за проведение некоторых экспериментов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Янулайтис А. А. Рестрикционные эндонуклеазы // ЖВХО.-1984.-Т. 29, .№ 2.
2. Бурьянов Я. И. Системы модификации и рестрикции ДНК как биологические факторы эволюции у микроорганизмов // Вопросы эволюции бактерии.- Пущино, 1984.
3. Murrey K. Restriction enzymes and their uses in genetic engineering / Genetic Engineering.- CRC Press, 1978.
4. Журавлева Л. И., Орешкин Е, Н. Влияние условий культивирования и ультра звукового разрушения биомассы Streptomyces achromogenes АТСС 12767 на выход эндонуклеаз рестрикции / Прикл, биохимия и микробиол.- 1985. Т. 21, № 3.
5. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхард. М.: Мир, 1980.
6. Краткий определитель бактерий Берги/Под ред. Д. Хоулт.-М.: Мир, 1980.
7. Белавин П. А., Дедков В. С, Дегтярев С. X. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий / Прикл. биохимия и микробиол.- 1988.- Т. 24, № 1. (интернет-версия)
8. Green P. L., Heyneker et al, A general method for the purification of restriction enzymes // Nucl. Acids Res. 1978. V. 3, N 2.
9. Shibatа Т.. Ikawa S. et al. Site-specific deoxyribonucleases in Bacillus subtilis and other Bacillus strains // J. Bad 1976.- V. 128,
10. Нетесов С. В., Грачев С. А. Эффективный метод выделения эндонуклеаз реестрикции / Биоорган, химия. 1381.- Т. 7, № 5.
11. Уонт Д., Кооней Ч. и др. Ферментация и технология ферментов,- М.: Легкая промышленность, 1083.
12. Репин В. Е., Божко Н. А., Щелкунов С. Н. Оптимизация культивирования штаммов-продуцентов ферментов нуклеинового обмена. Всесоюз. конф. "Новые направления биотехнологии". Пущино, 1986.
13. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике.- М Мир. 1976