function keepAlive() { var myAjax = new Request({method: "get", url: "index.php"}).send();} window.addEvent("domready", function(){ keepAlive.periodical(3600000); });
Главная  //  Научные статьи  //  Методы исследования  //  Расщепление ДНК, адсорбированной на поверхности фосфолипидных мембран, рестриктазами типа II

Расщепление ДНК, адсорбированной на поверхности фосфолипидных мембран, рестриктазами типа II

 

Будкер В. Г., Дегтярев С. X., Соколов А. В.

Биохимия, Т. 51, вып. 9, 1986, С 1496 - 1498

 

Изучен гидролиз ДНК фага λ рестриктазами типа II в присутствии модельных мембран из яичного фосфатидилхолина. Показано, что степень гидролиза ДНК ферментами BspI, PstI и BamHI в этих условиях резко снижена. Это не связано с необратимой инактивацией ферментов или их взаимодействием с мембраной. Наиболее вероятное объяснение ингибирования гидролиза ДНК в присутствии фосфолипидных везикул - изменение субстратных свойств ДНК в результате ее адсорбции на поверхности фосфолипидной мембраны при участии ионов Mg2+.

 

В присутствии двухвалентных катионов (Са2+ или Mg2+) ДНК образует прочные комплексы с модельными фосфолипидными мембранами или липидными участками природных мембран [1]. Комплекс формируется в результате взаимодействия катиона с фосфатными группами полинуклеотида и липида. Адсорбция на мембране существенно влияет на характер взаимодействия ДНК с рядом ферментов. В частности, это приводит к ингибированию гидролиза ассоциированной ДНК ДНКазой [2].
В данной работе изучен гидролиз ДНК, адсорбированной на фосфолипидных везикулах рестриктазами типа II.



МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рестриктазы BspI, PstI и BamHI - отечественного производства. Фаговая ДНК С1857 получена из научно-производственного объединения "Фермент" (Вильнюс). Фосфатилхолин из куриных яиц получали, как описано в работе [3]. Липосомы диаметром ~3000 Å получали, используя модифицированный вариант метода [4], инъекцией раствора липида в диэтиловом эфире в буфере 6 мМ трис-HCl, рН 7.5, 6 мМ NaCl, 6 мМ β-меркаптоэтанол, как описано в работе [2]. Гидролиз ДНК рестриктазами проводили при 37°C в реакционной смеси объемом 10 мкл, содержащей 0.5 мкг ДНК, 5 ед. фермента в 6 мМ трис-HCl, рН 7.5, в присутствии 6 мМ NaCl, 5 mM MgCl2 и 6 мМ-β-меркаптоэтанол. В большинстве экспериментов с липосомами реакционная смесь содержала 20 мкг фосфатидилхолина. По окончании реакции к смеси добавляли DS-Na, до концентрации 1%, ЭДТА до 20 мМ. Смесь прогревали 10 мин при 60°C, добавляли 5 мкл 50% глицерина и наносили на 1%-ный агарозный гель. Электрофорез проводили в 50 мМ трис-ацетатном буфере, содержащем 20 мМ ацетат Na, 2 мМ ЭДТА, 10-3 мМ бромистый этидий, рН 8.3, при напряжении 5 В/см. Гель фотографировали при освещении ультрафиолетовым светом.



РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Инкубация ДНК фага λ с липосомами из фосфатидилхолина в присутствии 5 мМ MgCl2 приводит, как показано в работе [1], к количественной адсорбции полинуклеотида на поверхности мембраны. В этих условиях, как видно на рис. 1, наблюдается существенное ингибирование гидролиза ДНК рестриктазами BspI, PstI и BamHI. В реакционной смеси сохраняется исходная ДНК и накапливаются промежуточные продукты гидролиза. Степень ингибирования несколько отличается для изученных ферментов, но качественно эффект для этих трех рестриктаз аналогичен. Необходимо отметить, что степень гидролиза не зависит от того, добавляется ли в реакционную смесь к липосомам сначала ДНК (при этом немедленно формируется комплекс ДНК - мембрана), а затем фермент или наоборот.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper21_fig1.jpg

 

 

Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза ДНК бактериофага λ различными рестриктазами; 1 - исходная ДНК; 2, 3, 4, 5 - ДНК после инкубации с PstI; 6, 7, 8, 9 - с BamHI; 10, 11, 12, 13 - с BspI; 3, 7, 11 - в отсутствие липосом, инкубация 60 мин; 2, 6, 10 - в присутствие липосом (2 мг/мл), инкубация 60 мин; 4, 8, 12 - в присутствии липосом, инкубация 75 мин; 5, 9, 13 - в присутствии липосом, инкубация 60 мин, затем добавление тритона X-100 до 0.5% и инкубация 15 мин

 

 



На рис. 2 показана зависимость степени гидролиза ДНК рестриктазой PstI от времени инкубации. В присутствии липосом часть ДНК быстро гидролизуется, а затем реакция либо полностью прекращается, либо сильно замедляется. Устойчивыми к расщеплению оказываются не только целые молекулы, но и промежуточные продукты (фрагменты) ее гидролиза.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper21_fig2.jpg

 

 

Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза ДНК &lambda в присутствии (2 мг/мл) липосом - (1 - 6) и в отсутствие липосом (7 - 12). Реакцию останавливали после 1 мин (1, 7), 5 мин (3, 9), 30 мин (4, 10), 45 мин (5, 11), 60 мин (6, 12) инкубации

 

 



Увеличение концентрации липосом в реакционной смеси повышает устойчивость ДНК к гидролизу PstI (рис. 3).

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper21_fig3.jpg

 

 

 Рис. 3. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза ДНК λ PstI при разных концентрациях липида: 2 мг/мл (3), 5 мг/мл (4), 8 мг/мл (5), 12 мг/мл (6) и 15 мг/мл (7); 1 - исходная ДНК, 2 - в отсутствие липида

 

 

 



Можно рассмотреть следующие возможные причины защиты липосомами ДНК от гидролиза рестриктазами: а) в присутствии липосом происходит необратимая инактивация ферментов; б) ферменты адсорбируются на мембране, что приводит к подавлению их активности; в) взаимодействие ДНК с мембраной снижает ее субстратные свойства.
Чтобы проверить, сохраняют ли рестриктазы свою активность после инкубации в присутствии липосом, полную реакционную смесь выдерживали в течение 1 ч., затем разрушали мембраны тритоном Х-100 и смесь инкубировали 15 мин. Это приводило к практически полному гидролизу ДНК (рис. 1). Таким образом, ясно, что ферменты сохраняют функциональную активность в течение всего эксперимента. Способность рестриктаз образовывать прочные комплексы с фосфолипидными мембранами была проанализирована на примере PstI. Фермент инкубировали 15 мин при 37°C с мультиламеллярными липосомами из фосфатидилхолина. Смесь центрифугировали 15 мин при 10 000 g. В этих условиях липосомы количественно осаждаются. К супернатанту добавляли ДНК λ и скорость ее гидролиза сравнивали с контролем, в котором фермент не инкубировали с липосомами. Оказалось, что отличий между опытом и контролем нет. Таким образом, по крайней мере, PstI, не формирует стабильных комплексов с мембраной.
Приведенные данные указывают на то, что ингибирующее действие липосом на гидролиз ДНК рестриктазами, не обусловлено взаимодействием ферментов с мембранами. Более вероятно предположение, что торможение гидролиза связано с адсорбцией ДНК на поверхности мембраны и снижением в результате этого ее доступности действию фермента. Комплекс ДНК с фосфолипидной мембраной формируется, по-видимому, в результате взаимодействия катиона (Mg2+ или Са2+) с фосфатами полинуклеотида и липида и может быть диссоциирован одновалентными катионами [1]. На рис. 4 показано, что добавление NaCl в реакционную смесь, содержащую ДНК, PstI, липосомы и 5 мМ MgCl2 приводит к заметному увеличению степени гидролиза ДНК. Однако полного расщепления ДНК не происходит. Как показано [5], адсорбция ДНК на поверхности фосфолипидной мембраны приводит к транслокации части молекул ДНК (5-10%) во внутренний объем везикул по механизму, подобному эндоцитозу. Эта ДНК не освобождается из липосом при добавлении NaCl и, возможно, составляет не гидролизуемую фракцию (рис. 4, дорожки 3 и 4). Основная же часть ДНК, устойчивая к гидролизу в составе комплекса с липосомами, расщепляется ферментом при диссоциации комплекса.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper21_fig4.jpg

 

 

 

Рис. 4. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза ДНК λ PstI (при концентрации MgCl2 0.005 М) в присутствии липосом - (2-4) и в отсутствие липосом (5, 6) при концентрации NaCl: 0.01 М (2), 0.04 М (3, 5) и 0.08 М (4, 6); 1 - исходная ДНК

 

 



Таким образом, наиболее вероятное объяснение ингибирующего действия липосом - снижение доступности ДНК, адсорбированной на поверхности фосфолипидных мембран для рестриктаз типа II, возможно, в результате стерических затруднений взаимодействия фермента с полинуклеотидом или изменения конформации ДНК [7].
Из анализа кинетики гидролиза адсорбированной ДНК PstI (рис. 2) видно, что существуют два состояния для сайтов рестрикции: доступные и практически полностью недоступные для фермента. Доля доступных сайтов снижается при увеличении концентрации липида. Следует отметить, что уже при концентрации липида 2 мг/мл ДНК полностью связана с липосомами, и формальный расчет показывает, что поверхность липосом превосходит поверхность ДНК. Кажется вероятным, что фрагменты ДНК, непосредственно взаимодействующие с мембраной, недоступны гидролизу, но, возможно, сохраняются петли полимера, по которым происходит ферментативная атака.
В заключение необходимо отметить, что диапазон концентраций двух- и одновалентных катионов, при которых наблюдается формирование и диссоциация комплексов ДНК с мембраной, близок к физиологическим [6]. Следовательно, можно думать, что в тех случаях, когда внутриклеточная концентрация ионов Mg2+ будет повышена, ДНК бактериофага, проникшая в бактериальную клетку, может адсорбироваться на фосфолипидных участках мембраны клетки-хозяина, что, по-видимому, приводит к защите ДНК от действия клеточных рестриктаз.



ЛИТЕРАТУРА

  1. Budker V. G., Godevikov A. A., Naumova I. A., Slepneva I. A. Nucleic Acids Res., 1980, v. 8, p. 2499-2515.
  2. Беляев Н. Д., Будкер В. Г., Максимова Т, Г., Наумова Л. П., Соколов А. В. Молекуляр. биология, 1982, № 16, с. 612-618.
  3. Бергельсон Л. Д., Дятловицкая Э. В., Молотковский Ю. Г. Препаративная биохимия липидов. М.: Наука, 1981, с. 25-66.
  4. Deamer D., Bangham A. D. Biochem. et biophys. acta, 1976, v. 443, p. 629-634.
  5. Будкер В. Г., Горохова О. В., Соколов А. В. Докл. АН СССР, 1984, т. 278, с. 479- 482.
  6. Damadian R. Biophys. J., 1971, v. 11, p. 739-760.
  7. Drew H. R., Travers A. A. Nucleic Acids Res., 1985, v. 2, p. 4445-4467.