function keepAlive() { var myAjax = new Request({method: "get", url: "index.php"}).send();} window.addEvent("domready", function(){ keepAlive.periodical(3600000); });
Главная  //  Научные статьи  //  Методы исследования  //  Модифицированный способ определения места расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции

Модифицированный способ определения места расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции

 

Г. Г. Приходько, Н. А. Петров, В. Е. Чижиков, С. X. Дегтярев

Биотехнология, 1988, том 4, № 5, с 618 - 620

 

Успехи молекулярной биологии и генетической инженерии во многом определяются наличием широкого ассортимента эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз), список которых ежегодно пополняется новыми наименованиями [1]. Обнаруживаемые ферменты необходимо охарактеризовать как по узнаваемой ими последовательности, так и по месту расщепления цепи ДНК. Идентификация сайта узнавания в настоящее время не представляет проблемы. С этой целью обычно используют совместный гидролиз ДНК изучаемыми ферментами и ферментами известной специфичности [2—4] либо сравнивают экспериментальные данные с предполагаемыми картинами расщепления маркерной ДНК по сайтам узнавания [5—8].

 

Браун и Смит разработали общий метод для установления места расщепления ДНК [9]. Однако ввиду его громоздкости он не нашел широкого применения. Более часто применяют следующие два подхода. Согласно первому радиоактивную метку вводят в концы фрагментов, образующихся при гидролизе исследуемой рестриктазой, с целью установления последовательности оснований вблизи места разрыва (2, 3, 6, 7]. Но при этом возникают трудности с изучением выступающих 3'-концов, а также при определении точек разрыва для эндонуклеаз рестрикции II-S-типа. Этих недостатков лишен метод прямого определения места гидролиза ДНК, в котором метку вводят в 5'-конец фрагмента ДНК, содержащего сайт узнавания искомой рестриктазы. Установление последовательности нуклеотидов такого фрагмента по методу Максама-Гилберта с параллельным ферментативным гидролизом меченого фрагмента позволяет определить место расщепления ДНК [4, 10-13]. Известно, однако, что модификация оснований по методу Максама-Гилберта приводит к появлению дополнительного по сравнению с продуктами ферментативного гидролиза фосфата на 3'-конце [14]. Это приводит к заметной разнице в подвижности фрагментов ДНК при электрофорезе, что затрудняет интерпретацию полученных результатов.
В данной работе предложен простой способ определения точек расщепления ДНК различными рестриктазами. Он основан на химической и ферментативной обработке меченых по 3'-концу фрагментов ДНК. При этом продукты расщепления будут иметь одинаковое строение, а, следовательно, и подвижность при электрофорезе.



УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В работе использованы α-32P-dATP, ферменты HindIII, EcoRI и MspI производства НПО "Фермент", г. Вильнюс; ферменты ClaI, FokI и фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli - НПО "Вектор", г. Новосибирск.
Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции, введение 3'-концевой радиоактивной метки, очистку фрагментов ДНК, секвенирование и электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили в основном, как описано в работах [14, 15]. Для работы использовали 0.1-0.5 пмоля 3'-меченого фрагмента ДНК. Аликвоту, составляющую около 5% от этого количества, гидролизовали препаратом исследуемого фермента в соответствующих условиях в течение 10-30 мин. Реакцию останавливали добавлением формамида до 80% и тепловой денатурацией в течение 2 мин на кипящей бане с последующим быстрым охлаждением во льду. Для электрофореза использовали 1/40 часть полученной смеси.



РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При последовательной обработке ДНК гидразином и пиперидином, приводящей к расщеплению по пиримидиновым звеньям 3'-меченого фрагмента ДНК, изображенного на рис. 1, образуется 4 радиоактивных продукта.
Гидролиз этого же фрагмента ДНК рестриктазой Cla I даст только один меченый фрагмент, полностью совпадающий со вторым по величине продуктом химического расщепления. Таким образом, 3'-меченый фрагмент ДНК, содержащий сайт узнавания исследуемой рестриктазы, необходимо секвенировать по методу Максама- Гилберта [14], а небольшую аликвоту его гидролизовать изучаемым ферментом. Совместный электрофорез (на параллельных дорожках) в денатурирующем геле продуктов химического расщепления по четырем основаниям и ферментативного гидролиза позволит одновременно расшифровать первичную структуру участка ДНК и точное место разрыва цепи эндонуклеазой.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper17_fig1.gif

 

 

Рис. 1. Продукты ферментативного и химического (гидразин + пиперидин) гидролиза 3'-меченого фрагмента ДНК. Звездочкой отмечен радиоактивный фосфат, стрелкой - место расщепления рестриктазой, подчеркнут сайт узнавания

 

 



В качестве примера мы приводим результаты определения сайтов расщепления эндонуклеаз рестрикции HindIII, FokI и ClaI. Как известно, плазмида pBR322 содержит вблизи сайта узнавания рестриктазы EcoRI также сайты рестриктаз Clal, HindIII и Fokl [15]. После расщепления плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и Mspl в EcoRI-концы продуктов гидролиза была селективно введена метка с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli и α-32P-dATP. Меченый по одному 3'-концу фрагмент EcoRI-MspI размером 162 п.н., содержащий сайты рестрикции для упомянутых трех ферментов, был выделен с помощью гель-электрофореза и секвенирован по методу [14]. Параллельно его аликвоты были гидролизованы препаратами HindIII, ClaI и FokI. Радиоавтографы совместного электрофореза продуктов приведены на рис. 2, а расшифровка результатов на рис. 3.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper17_fig2.jpg

 

 

Рис. 2. Радиоавтографы гелей после электрофореза продуктов химического и ферментативного расщепления EcoRI-Mspl-фрагмента ДНК плазмиды pBR322 (162 п. н.), меченого по 3'-EcoRI-концу
а - 12%-ный ПААГ: 1 - продукты гидролиза рестриктазой HindIII; 6 - ClaI; 6-4%-ный ПААГ: 1,6 - продукты гидролиза эндонуклеазой рестрикции FokI; 2-5 - в обоих случаях продукты химического расщепления фрагмента ДНК по методу Максама-Гилберта (2 - G, 3 - A+G, 4 - Т+С, 5- С)

 

 

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper17_fig3.gif

 

 

Рис. 3. Результаты определения мест расщепления цепи ДНК рестриктазами HindIII, ClaI (а) и FokI (б). Стрелками отмечены места расщепления, подчеркнуты сайты узнавания. Нумерация нуклеотидных остатков в последовательности pBR322 дана от сайта узнавания EcoRI. Звездочками отмечены концевые радиоактивные нуклеотиды

 



Из полученных данных следует, что разрыв HindIII приходится, как и следовало ожидать, между основаниями А в последовательности AAGCTT, разрыв ClaI - между основаниями Т и С в последовательности ATCGAT, a FokI - на расстоянии 9 нуклеотидных остатков от сайта узнавания GGATG (в данном случае между основаниями С и G в последовательности AGCGCA). При этом необходимо помнить, что любая полоса на радиоавтографе продуктов химического расщепления соответствует олигонуклеотидному фрагменту, остающемуся после удаления указанного основания из цепи и ее разрыва (см. рис. 1). Тем самым, совпадение полос в химическом и ферментативном гидролизатах говорит о том, что расщепление цепи ферментом происходит между данным основанием и нижеследующим. Определение точки разрыва в комплементарной цепи при действии этих рестриктаз можно провести, пометив тот же фрагмент с противоположного MspI-конца и повторив процедуру. Преимущество предлагаемого способа состоит как в наглядности результата, так и в том, что полнота гидролиза фрагмента несущественна. Для определения места расщепления достаточно следовой активности фермента. Единственным условием является отсутствие значительных примесей экзонуклеаз в исследуемом препарате, которые могут количественно отщепить метку с 3'-конца тест-фрагмента. Предлагаемый метод был использован нами при установлении места расщепления ДНК рестриктазами Vspl [16] и Vnel [17].



ЛИТЕРАТУРА

  1. Kessler С.. Neumaier Т. С . Wolf W.-Gene, 1985, v. 33, N 1, р. 1-102.
  2. Bitinaite J. S., Klimasauskas S. /., Butkis V. V. et al.- FEBS Lett., 1985, v. 182, N 2, р. 509-513.
  3. Khosaka Т., Kiwaki M.- Gene, 1984, v. 31, N 1-3, р. 251-255.
  4. Grosskopf R.. Wolf W.. Kessler С.- Nucl. Acids Res., 1985, v. 13, N 5, p. 1517-1528.
  5. Barker D.. Hoff M.. Oliphant A. et al. Nucl. Acids Res., 1984, v. 12, N 14, p. 5567-5581.
  6. Sasaki I., Yamada Y.- Agric. Biol. Chem., 1984, v. 48, N 12, p. 3027-3034.
  7. Qiang B.-O.. Schildkrauf /.- Nucl. Acids Res., 1986, v. 14, N 5, p. 1991-1999.
  8. Whitehead Ph.. Brown N.-J. Gen. Microb., 1985, v. 131, N 4, p, 951-958.
  9. Brown N., Smith M.- Methods in Enzymology, 1980, v. 65, p. 391-404.
  10. Bolton В., Neseh G., Comer M. et al.- FEBS Lett., 1985, v. 182, N 1; p. 130-134.
  11. Brown N.. Smith M-FEBS Lett., 1976, v. 65, N 3, p. 284-287.
  12. Klied D., Humayun Z.., Jeffrey A. et al.-Proc. Natl. Acad, Sci. US, 1976, v. 73, N 2, p. 293-297.
  13. Tapper D. P.. Clayton D. A.- Nucl. Acids Res., 1981, v., 9, N 24, p. 6787-6794.
  14. Maxam A. M., Gilbert W. 0.- Proc. Natl. Acad. Sci. US, 1977, v. 74, N 2, р.. 560-564.
  15. Маниатис Т., Фрич Э., Сзмбрук Дж.- В кн.: Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.- M.: Мир, 1984.
  16. Дегтярев С. X., Репин В. Е., Речкунова Н. И. и др.-Биоорган, химия, 1987, т. 13, № 3, с. 420-421.
  17. Дегтярев С. X., Речкунова Н. И., Нетесова Н. А. и др.- Биоорган, химия, 1987, т. 13, № 3, с. 422-423.