Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции

 

Дегтярев С. X., Белавин П. А., Шишкина И. Г., Зарытова В. Ф., Гаврюченкова Л. П., Морозов С. М.

Биоорганическая химия, Т 15, № 3, 1989, С. 358 - 362

 

Предложен метод аффинной хроматографии эндонуклеаз рестрикции IIS-типа. Показано, что рестриктазы HgaI, FokI, SfaNI избирательно связываются на носителе с иммобилизованным дуплексом (один из олигонуклеотидов которого ковалентно связан с полимерным носителем), содержащим сайты узнавания этих ферментов, но неспособным гидролизоваться ими.

 

Изучение свойств эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз) - одно из важных направлений исследования взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Это связано с тем, что указанные ферменты узнают и специфически гидролизуют ДНК в присутствии ионов Mg2+ по разнообразным, но в каждом случае определенным, коротким последовательностям длиной 4-8 пар оснований (так называемые эндонуклеазы рестрикции типа II) [1, 2]. Среди них есть небольшая группа ферментов (их называют ферментами IIS-типа), которые гидролизуют ДНК также строго однозначно, но в стороне от сайта узнавания [3, 4]. Например, рестриктаза FokI, выделяемая из микроорганизма Flavobacterium okeanokoites, узнает дуплекс GGATG/CCTAC (далее вторая цепь сайта узнавания не приводится) и расщепляет двухцепочечную последовательность ДНК в местах, указанных стрелкой, т. е. после 9-го нуклеотида от места узнавания в верхней и 13-го в нижней нуклеотидной цепи дуплекса (или сокращенно GGATG(9/13)) [3, 4]:

GGATGNNNNNNNNN^NNNN
ССTACNNNNNNNNNNNNN^



Содержание ферментов IIS-типа в клетках соответствующих бактерий невелико, и выделение их - трудная задача. На наш взгляд, одним из перспективных подходов при получении таких ферментов стала бы хроматография на носителе, содержащем ковалентно фиксированный олигонуклеотид, способный образовывать с комплементарным (не иммобилизованным) олигонуклеотидом дуплекс. В состав такого дуплекса должны входить сайты узнавания рестриктаз и не должно быть участка, по которому происходит расщепление. Такой сорбент должен обладать аффинными свойствами и быть устойчивым к действию самих рестриктаз.
Актуальность такой работы обусловлена и возросшим интересом генной инженерии к высоко-очищенным препаратам рестриктаз IIS-типа [3, 5] при их высокой стоимости [6].
Цель настоящего исследования - изучение взаимодействия сорбента, содержащего сайты узнавания для рестриктаз FokI, HgaI, SfaNI, с этими и другими ферментами.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper19_fig1.gif

 

 

Рис. 1. (Ia) - сорбент с ковалентно присоединенным олигонуклеотидом; (Iб) - сорбент с иммобилизованным олигонуклеотидным дуплексом, содержащим сайты узнавания рестриктаз

 

 

Как известно, рестриктазы FokI, HgaI, SfaNI имеют следующие сайты узнавания и места разрезания: GGATG(9/13), GACGC(5/10), GCATC(5/9) соответственно [6]. Нами был синтезирован дуплекс, включающий в себя сайты узнавания этих ферментов, но не содержащий участка, по которому происходит гидролиз ДНК. На рис. 1 приведена структура полученного дуплекса, где скобками обозначены соответствующие сайты узнавания. Один из нуклеотидов дуплекса, а именно pTTGGATGACGCATCTT, был ковалентно присоединен к полимерному носителю через 5'-концевую фосфатную группу (сорбент (Ia)). Для получения аффинного сорбента (Ib) к полимеру (Iа) добавляли комплементарный иммобилизованному олигонуклеотид AAGATGCGTCATCCAA. Количество комплементарного олигонуклеотида, связавшегося с сорбентом (Ia), определенное спектрофотометрически промывкой сорбента (Ib) 3 M раствором мочевины при 60°С, составило 3 мг (0.6 мкмоль) на 1 г сорбента.
Аналогичным образом был получен сорбент (IIa) с иммобилизованным олигонуклеотидом р(АС)6, способным образовывать дуплекс с (GT)6 (сорбент (IIb)). Следует подчеркнуть, что специальными экспериментами было показано, что полимеры с иммобилизованными олигонуклеотидами образовывали прочные комплексы лишь с олигонуклеотидами, имеющими комплементарные последовательности.
На первом этапе с помощью колоночной хроматографии изучали взаимодействие рестриктазы FokI с сорбентами (Ia) и (Ib) в присутствии ионов Mg2+ и без них. В каждом случае устанавливали концентрацию NaCl, при которой фермент элюируется с колонки. Чем раньше фермент вымывается с сорбента, тем слабее он с ним взаимодействует, т. е. тем меньше у него сродство к олигонуклеотиду в данных условиях. Оказалось, что рестриктаза FokI связывается и с одноцепочечным (сорбент (Ia)), и с двухцепочечным (сорбент (Ib)) олигонуклеотидом, причем связывание в последнем случае лучше (табл. 1). Ионы Mg2+ практически не влияют на сродство фермента к олигонуклеотиду, что согласуется с имеющимися к литературе данными [7-9].
Важно было выяснить, какие различия по связыванию имеются у синтезированных сорбентов с другими ферментами типа II, не имеющих сайта узнавания в олигонуклеотидах сорбента. Для этого мы исследовали связывание RsaI (сайт узнавания GTAC), NotI (GCGGCCGC), Bme18I (GGATCC), PvuII (CAGCTG), а также HgaI, FokI, SfaNI. Хроматографию проводили на сорбенте (Ib) и на контрольном сорбенте (IIb) в отсутствие ионов Mg2+. Для этого ферменты в количестве 200-500 ед. акт. диализовали против буфера (0.02 M К-фосфат (рН 7.5) 5x10-4 M EDTA, 10-3 M 2-меркаптоэтанол), наносили на сорбент и элюировали как описано в "Экспериментальной части". Тестирование активности ферментов проводили в рекомендуемых условиях [6].
В табл. 2 представлены значения концентрации NaCl, при которой происходит элюирование ферментов. Из приведенных данных видно, что все испытанные ферменты при нейтральных значениях рН и в отсутствие ионов Mg2+ связываются с обоими сорбентами. Однако специфическое связывание (ферменты FokI, SfaNI, HgaI) четко отличается от неспецифического. В самом деле, ферменты, чей сайт узнавания отсутствует в олигонуклеотиде сорбентов, в обоих случаях элюируется при 0.15±0.04 M NaCl независимо от размеров сайта (табл. 2). В то же время фермент FokI на сорбенте (IIb) вымывается при 0.14 M NaCl, а на сорбенте (Ib) - при 0.28 M NaCl. Это позволяет говорить, что предлагаемый нами сорбент является аффинным для рестриктаз IIS-типа.

 

Условия хроматографии
[NaCl], M
Сорбент
[MgCl2] 10-3, M
(la)
0
0.16±0.03
(la)
5
0.16±0.03
(Ib)
0
0.28±0.03
(Ib)
5
0.29±0.03

 Таблица 1. Концентрация NaCl, необходимая для элюции рестриктазы FokI с сорбентов типа ( I )

 

 

Фермент
Сорбент (Ib)
Сорбент (IIb)
Фермент
Сорбент (Ib)
Сорбент (IIb)
FokI
0.28
0.14
Bmu18I
0.16
0.15
SfaNI
0.28
0.13
PvuII
0.14
0.14
HgaI
0.32
0.19
NotI
 
0.12
RsaI
0.11
0.14
     

 Таблица 2. Концентрация NaCl (M), необходимая для элюции рестриктаз


Аналогичные результаты получены с соответствующими метилазами, для которых данный сорбент также оказался аффинным (данные не приводятся).
Для определения величины аффинной емкости сорбента (Ib) в пять пробирок объемом 1.5 мл помещали 0.07; 0.15; 0.3; 0.6; 1.2 мг сорбента и добавляли по 100 ед. акт. фермента FokI. Образцы инкубировали 10 мин при 0°С, затем центрифугировали и в супернатанте определяли активность фермента (см. "Экспериментальную часть"). По специфическому расщеплению ДНК фага λсI 857 видно, что ферментативная активность проявляется в супернатанте двух первых пробирок (рис. 2, дорожки 1 и 2). Таким образом, 0.3 мг сорбента (Ib) (рис. 2, дорожка 3) достаточно для полного связывания 100 ед. акт. FokI, а емкость полимера (Ib) составляет не менее 300 000 ед. акт. на 1 г сорбента.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper19_fig2.jpg

 

 

Рис. 2. Электрофореграмма специфического расщепления ДНК фага &labmda;cI 857 рестриктазой FokI после предварительной инкубации 100 ед. акт. фермента с 0.07 (2), 0.15 (2), 0.3 (3), 0.6 (4), 1.2 мг (5) сорбента (Ib)

 

 



Для оценки стабильности сорбента (Ib) после проведения 10-12 хроматографии его промывали 3 M мочевиной при 60°С. Это приводило к превращению полимера (Ib) в (Ia) и появлению в растворе олигонуклеотида AAGATGCGTCATCCAA. Было определено, что количества первоначально связавшегося в дуплекс и десорбированного олигонуклеотида практически совпадают. Полученные данные свидетельствуют, что данный сорбент достаточно стабилен и может применяться для выделения рестриктаз типа II.



ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали полимерный носитель солоза-Нγ-65 отечественного производства [10], олигонуклеотиды синтезировали: pTTGGATGACGCATCTT, р(АС)6 - фосфотриэфирным методом из защищенных динуклеотидов [11]; AAGATGCGTCATCCAA, (GT)6- фосфитамидным методом в автоматическом варианте на установке "Виктория-4М" [12]. Все олигонуклеотиды выделяли ВЭЖХ с помощью хроматографа Altex-332 (США) на колонках размером 10x250 мм. В качестве носителя для ионообменной хроматографии использовали Partisil 10 SAX (Whatman, Англия), для обращенно-фазовой - Lichrosorb RP-18 (Merck, ФРГ).
В работе также использовали дипиридилдисульфид (Fluka, Швейцария), трифенилфосфин (Chemapol, Чехословакия), N-метилимидазол (Ega, ФРГ), а также ферменты RsaI (сайт узнавания GTAC), Bme18I (GGATCC), PvuII (CAGCTG), NotI (GCGGCCGC), FokI (GGATG), HgaI (GACGC), SfaNI (GCATC) (КФ 3.1.23, НПО "Вектор", пос. Кольцово Новосибирской обл.).
Сорбент (Ia) получали, используя реакцию аминогрупп полимера с активированной 5'-фосфатной группой олигонуклеотида pTTGGATGACGCATCTT. Активацию фосфата осуществляли смесью 2,2'-дипиридилдисульфида и трифенилфосфина в присутствии N-метилимидазола [13] и вводили в реакцию с аминогруппами полимерного носителя. Спектрофотометрический анализ кислотного гидролизата аликвоты полученного сорбента показал, что 1 г полимера содержит 5.2 мг (1 мкмоль) иммобилизованного олигонуклеотида.
Аффинный сорбент (Ib). 20 мг сорбента (Ia) промывали 1 мл воды, 2 мл водного буфера 0.5 M КС1 и 0.01 M трис-HCl (рН 7.5) и наносили 0.06 мг (12 нмоль) олигонуклеотида AAGATGCGTCATCCAA в том же буфере. Полученный аффинный сорбент промывали буфером 0.5 M КС1, 0.01 M трис-HCl (рН 7.5), а затем буфером 0.02 M К-фосфат (рН 7.5), 5x10-4 M EDTA, 10-3 M 2-меркаптоэтанол до отсутствия оптического поглощения при 260 нм.
Аффинную хроматографию проводили на колонке с 0.3 мл (120 мг) сорбентов (Ia), (Ib), (IIa), (IIb). На колонку, уравновешенную буфером 0.02 M К-фосфат (рН 7.5), 5x10-4 M EDTA, 10-3 M 2-меркаптоэтанол при 4°С, наносили 500 ед. акт. фермента, диализованного против этого буфера. Колонку промывали указанным выше буфером, связавшийся белок элюировали, используя градиент концентрации NaCl от 0 до 1 M в этом же буфере, собирая фракции по 250 мкл.
Ферментативную активность во фракциях определяли стандартным образом по гидролизу 1 мкг ДНК фага λсI 857 с последующим электрофорезом продуктов реакции в 1% агарозе [1]. Условия проведения реакции гидролиза ДНК соответствовали рекомендуемым [14]. За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для проведения полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага λсI 857 за 1ч при 37°С.



ЛИТЕРАТУРА

  1. Roberts R. J. // Nucl. Acids. Res. 1987. V. 15. P. 189-217.
  2. Modrich P. // Crit. Rev. Biochem. 1982. V. 13. P. 287-323.
  3. Szybalski W. II Gene. 1985. V. 40. № 2-3. P. 169-173.
  4. Podhajska A., Szybalski W. // Gene. 1985. Y. 40. № 2-3. P. 175-182.
  5. Vermersch P. S., Bennett B. N. // Gene. 1987. V. 54. № 2-3. P. 229-238.
  6. Biolabs//catalog. 1986-1987.
  7. Halford S. E., Johnson N. P. // Biochem. J. 1980. V. 191. P. 593-604.
  8. Jack W. E., Terry B. J., Modrich P.//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 4010-4014.
  9. Terry B. J., Jack W. E., Rubin R., Modrich P. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 9820-9825.
  10. Гаврюченкова Л. П., Морозов С. M., Болдырев А. Г., Цуканова Л. Н., Константинов В. В., Белая С. Ф., Пасечник В. А. Способ получения полимерных гидрофильных носителей для хроматографии: А.с. 1398902 СССР // Б. И. 1988. № 20. С. 27.
  11. Зарытова В. Ф., Иванова Е. М., Кутявин И. В. // Биоорган, химия. 1982. Т. 8. № 2. С. 224-230.
  12. Грязнов С. М., Горн В. В., Зарытова В. Ф., Кумарев В. П., Левина А. С, Полищук А. С. //Изв. СО АН СССР. Сер. хим. наук. 1987. Вып. 1. № 2. С. 119-123.
  13. Годовикова Т. С., Зарытова В. Ф., Халимская Л. М. // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. № 4. С. 475-481.
  14. Maniatis Т., Fritsch E, Sambrook J. II Molecular Cloning: a laboratory manual / N. Y.: Cold Spring Harbor, 1982.