Клонирование системы рестрикции-модификации BpuN4I из Bacillus Pumilus N4

Категория: Методы исследования
Просмотров: 9773

 

В.С. Дедков, Д.А. Гончар, В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, Е.Н. Ломаковская, Н.М. Шинкаренко, С.Х. Дегтярёв

 

 

ДНК бактериального штамма Bacillus pumilus N4, несущего систему рестрикции-модификации BpuN4I (сайт узнавания 5’-GGNNCC-3’), гидролизовалась эндонуклеазами рестрикции MfeI и EcoRI и полученные продукты клонировались в вектор pUC19, линеаризованный EcoRI. Для отбора клонов, несущих ген эндонуклеазы рестрикции BpuN4I, было предложено использовать метод селекции, основанный на делении (разведении) полученной библиотеки клонов с прямым определением активности эндонуклеазы рестрикции в суммарных лизатах клеток. С помощью данного метода был выявлен рекомбинантный штамм E. coli N41(pBpuN4/MR), являющийся продуцентом фермента BpuN4I. Также была проведена селекция полученной библиотеки традиционным методом Венецианера и получены два различных клона, один из которых идентичен E. coli N41(pBpuN4/MR), а второй, E. coli N7(pBpuN4/MR), содержит вставку в плазмиде в противоположном направлении и проявляет меньшую активность. Была установлена структура ДНК плазмидной вставки штамма E.coli N41(pBpuN4/M)R и показано, что она содержит гены ДНК-метилтрансферазы M.BpuN4I и эндонуклеазы рестрикции BpuN4I. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности ферментов, кодируемых данными генами, выявил гомологию M.BpuN4I с другими метилазами, узнающими сайт 5’-GGNNCC-3’ или сходный с ним. В аминокислотной последовательности M.BpuN4I выявлены все домены, характерные для 5мС-ДНК-метилтрансфераз.

 

 

Введение

Бактериальные системы рестрикции-модификации (РМ-системы) являются одним из интереснейших объектов, изучаемых в молекулярной биологии. РМ-система включает в себя, как минимум, два фермента - сайт-специфические эндонуклеазу рестрикции (рестриктазу) и ДНК-метилтрансферазу (метилазу) [1, 2]. В настоящее время успешное развитие многих направлений молекулярной биологии, генетической инженерии и ДНК-диагностики немыслимо без расширения ассортимента эндонуклеаз рестрикции, которые являются одними из ключевых инструментов в этих областях науки.

Выделение эндонуклеаз рестрикции из природных штаммов часто осложняется необходимостью использования большого количества биомассы, сложных схем выделения, включающих хроматографии с дорогостоящими сорбентами, а также малым выходом целевого продукта. В связи с этим актуальным является клонирование генов этих ферментов в составе векторов в E. coli с целью создания штаммов суперпродуцентов. Успешное клонирование, в свою очередь, зависит от возможности использования эффективных методов отбора (селекции) целевых продуцентов из тысяч рекомбинантных клонов. Следовательно, разработка и оптимизация новых методов селекции клонов достаточно актуальна.

Ранее было показано, что рестриктаза BpuN4I из Bacillus pumilus N4  расщепляет последовательность 5'-G^GNNCC-3' [3], являясь первым неошизомером NlaIV (5’-GGN^NCC-3', http://www.rebase.neb.com). В отличие от NlaIV при гидролизе ДНК рестриктазой BpuN4I образуются четырёхнуклеотидные 5’-выступающие липкие концы, сходные с концами, получающимися при расщеплении ДНК эндонуклеазами рестрикции XhoII и BstX2I (сайт узнавания 5’-R^GATCY-3’), Acc65I (5’-G^GTACC-3’), HgiC1I и AccB1I (5’-G^GYRCC-3’), BamHI (5’-G^GATCC-3’), PspOMI (5’-G^GGCCC-3’), а также рядом других ферментов, что позволяет эффективно применять фермент BpuN4I в разнообразных генно-инженерных манипуляциях. Однако продуктивность исходного штамма B.pumilus N4 невелика.

В данной работе мы клонировали эндонуклеазу рестрикции BpuN4I из B.pumilus N4. Для получения клона-продуцента фермента мы разработали метод селекции, основанный на делении (разведении) полученной библиотеки клонов с прямым определением активности эндонуклеазы рестрикции в суммарных лизатах клеток. Также была проведена селекция клонов по устойчивости к бактериофагу in vivo и по устойчивости рекомбинантной ДНК к рестриктазе BpuN4I in vitro. Установлена структура РМ-системы BpuN4I и проведен сравнительный аминокислотный анализ метилазы M.BpuN4I и рестриктазы R.BpuN4I, входящих в эту систему.

 

Материалы и методы

 

Штамм Esherichia coli ER2267 (F’ proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15 zzf::mini-Tn10 (Kanr)/Δ(argF-lacZ)U169 glnV44 e14- (McrA-) rfbD1. recA1 relA1. endA1 spoT1. Thi-1 Δ(mcrC-mrr) 114::IS10) получен из “New England Biolabs, Inc.” (США); штаммы: Bacillus pumilus N4, продуцент рестриктазы BpuN4I, Esherichia coli С600 (λcI857Sam7) и Esherichia coli QD5003 – получены из коллекции культур микроорганизмов НПО «СибЭнзим» (Новосибирск).

 

Определение активности эндонуклеазы рестрикции BpuN4I

Определение активности рестриктазы BpuN4I в бактериальной культуре проводили как описано ранее [4, 5]. Бактериальные клетки в количестве 0,05-0,2 мг суспендировали в 20 мкл лизирующего буфера, содержащего 0,2 мг/мл лизоцим (“AppliChem”, Германия), 0,1% Тритон Х-100 (“Sigma”, США), 10 мМ Трис-HCl (pH 8,1), 1 мМ ЭДТА и инкубировали 30 мин при 22°С. К полученному лизату добавляли 5 мкл смеси, содержащей 250 мкг/мл ДНК фага ламбда и 5-кратный SE-буфер Y (33 мМ Трис-ацетат (рН 7,9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия и 1 мМ ДТТ), и полученную смесь инкубировали 1 час при +37°С. По окончании реакции к смеси добавляли 2,5 мкл стоп-буфера (0,25 М Na-ЭДTA (pH 8,5), 50% сахароза, 0,1% бромфеноловый синий и 0,1 мг/мл РНКаза), перемешивали и 5 мкл полученной смеси наносили на 0,8% агарозный гель в буфере ТАЕ (40 мМ Трис-ацетат (рН 8,1), 20 мМ натрий ацетат, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мг/л этидия бромида). Электрофорез вели при напряжении 5 В/см в течение 70 мин и затем фотографировали гель в ультрафиолете на приборе “Herolab GmbH” (Германия).

 

Получение геномной библиотеки B. pumilus N4

Все генно-инженерные процедуры, а также работа с бактериофагом лямбда выполнялись согласно [6]. ДНК B.pumilus N4, продуцента рестриктазы BpuN4I, выделяли как описано ранее [7].

5 мкг ДНК B.pumilus N4 гидролизовали раздельно рестриктазами MfeI и EcoRI, как рекомендовано производителем. Полученные гидролизаты ДНК очищали экстракцией фенолом-хлороформом, переосаждали этанолом и полученный осадок растворяли в 25 мкл воды.

Для приготовления вектора готовили 400 мкл реакционной смеси, содержащей 40 мкл десятикратного SE-буфера EcoRI, 20 мкл ДНК pUC19 в концентрации 0,5 мг/мл, 340 мкл воды и 5 мкл рестриктазы EcoRI. Смесь инкубировали 1,5 часа при +37 °C, добавляли 20 единиц щелочной фосфатазы из кишечника теленка и инкубировали 30 мин при +37 °C. Далее ДНК очищали экстракцией фенолом-хлороформом, переосаждали этанолом и растворяли в 20 мкл буфера ТЕ.

Сшивку фрагментов ДНК B. pumilus N4 с полученным вектором проводили в 30 мкл смеси, содержащей 3 мкл десятикратного лигазного буфера, 3 мкл вектора pUC19/EcoRI, 15 мкл ДНК B. pumilus N4, гидролизованную ферментом EcoRI, 9 мкл ДНК B. pumilus N4, гидролизованную MfeI, и 1 мкл высокоактивной Т4-ДНК-лигазы и инкубировали в течение ночи при +4 °C. Затем ДНК осаждали этанолом и растворяли в 12 мкл воды.

Полученной таким образом смесью рекомбинантных ДНК трансформировали клетки E. coli штамма ER2267 путем электропорации на приборе «Easyject Prima». Перед электропорацией к 50 мкл размороженных во льду клеток добавляли 4 мкл лигазной смеси. После трансформации к суспензии клеток добавляли 1 мл нагретого до +37 °C бульона LB, и клетки подращивали при +37 °C в течение 1 часа. Для подсчёта трансформантов 10 мкл полученной культуры рассевали в чашке Петри на агаризованной среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировали ночь при +37 °C. Основную часть культуры засевали во флакон со 100 мл среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и выращивали в течение ночи в термостатированной воздушной качалке при +37 °C и 140 об./мин.

 

Селекция потенциальных продуцентов методом деления библиотеки клонов

При достижении оптической плотности 2,5 единицы при 540 нм культуру разбавляли ТМ-буфером (10 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 10 мM MgSO4 и 200 мкг/мл желатин) в 3000 раз и раскапывали в чашки Петри по 10 мкл на 30 секторов LB-агара с ампициллином. Чашки инкубировали 2 дня при 22°С. Каждую смесь колоний переносили петлёй в ячейку планшета и суспендировали в 100 мкл буфера, содержащего 25% глицерин, 40 мМ NaCl и 10 мМ Трис-HCl (pH 7,6), и хранили при -18°С. Параллельно из полученных суспензий отбирали аликвоты по 2 мкл в лизирующий буфер и тестировали активность рестриктазы как описано выше. Суспензию клеток, содержащую рестриктазу, разводили ТМ-буфером в 10 раз и снова раскапывали в чашки Петри по 10 мкл на 30 секторов LB-агара с ампициллином. Клетки подращивали и тестировали в них активность фермента как описано выше. Процедуру разведения повторяли до получения смеси клеток из единичных клонов (10-25 клонов), их рассевали на отдельные чашки и проводили определение активности фермента в отдельных клонах как описано выше.

Селекцию потенциальных продуцентов по устойчивости к бактериофагу проводили по методу, описанному ранее [8, 9]. Клетки E. coli, содержащие библиотеку ДНК B.pumilus N4, подращивали во флаконе со 100 мл среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в течение ночи в термостатированной воздушной качалке при +37°C и 140 об./мин. Культура достигала плотности 2,5 при 540 нм и имела титр 3х108 к.о.е./мл. 111 мкл культуры разбавляли в 1 мл ТМ-буфера и добавляли по 100 мкл в четыре ячейки планшета, содержащие по 100 мкл бактериофага лямбда с титром 12х108, 2,4х108, 0,48х108 б.о.е./мл а также ТМ-буфер без бактериофага. Инфицирование проводили 15 мин при +37°С. Затем клетки последовательно разводили 5 раз, каждый раз отбирая 11,1 мкл из смеси и добавляя их к 100 мкл ТМ-буфера. По 50 мкл из каждого разбавления рассевали в чашки Петри на 1,4%-ный питательный агар с 50 мкг/мл ампициллина. Инкубировали 1 час при +42°С, затем 20 часов при +37°С.  Снижение титра клеток в 1000 раз после инфекции со множественностью до 40 фаговых частиц на клетку (б.о.е/к.о.е.) рассматривали как результат селекции штаммов, потенциально устойчивых к бактериофагу.

 

Селекция потенциальных продуцентов по устойчивости рекомбинантной плазмиды к рестриктазе BpuN4I

Для отбора целевыхрекомбинантных плазмид по их устойчивости к действию рестриктазы BpuN4I использовали метод Венецианера [10], получивший название Hungarian trick и успешно применяемый для клонирования ферментов различных РМ-систем [11, 12]. При этом трансформантов E. coli, выращенных в 100 мл селективной среды, собирали на центрифуге “Beckman J2-21” (USA) при 6000 об./мин в течение 30 мин при 10°C. Из осадка выделяли суммарную плазмидную ДНК с использованием набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Germany) по инструкции производителя. Полученную библиотеку рекомбинантных плазмид с концентрацией ДНК 0,4 мг/мл обрабатывали 10 мкл рестриктазы BpuN4I в SE-буфере Y в течение 1 часа при 37°C. Гидролизат ДНК осаждали 96%-ным этанолом и растворяли в 15 мкл воды. Полученным гидролизатом трансформировали компетентные клетки E. coli штамма ER2267 при 42°C в течение 2 мин и высевали их в чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Инкубировали при 37°C в течение ночи и выделяли плазмидные ДНК из индивидуальных клонов. ДНК проверяли на наличие встроенного фрагмента и на устойчивость к гидролизу BpuN4I.

Выращивание рекомбинантных штаммов E. coli проводили в бульоне LB, содержащем 1% триптон (“Organotechnie”, Франция), 0,5% дрожжевой экстракт (“Organotechnie”, Франция), 0,5% NaCl, 0,05% MgCl2, 0,001% тиамин (рН 7,0) с добавлением 0,1 мг/мл ампициллина в двадцати колбах объёмом 500 мл, содержащих по 300 мл бульона, при +30°С со встряхиванием 130 об./мин в течение 18 часов. Клетки осаждали на центрифуге J2-21 («Beckman», США) в течение 30 минут в роторе JA-10 при 8000 об./мин и замораживали. Получили 12 г биомассы.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (“Applied Biosystems”, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Препараты ферментов, ДНК, дезоксинуклеозидтрифосфатов и  синтетических олигонуклеотидов, использованные в работе, произведены в НПО "СибЭнзим" (г. Новосибирск).

 

Результаты и обсуждение

 

Клонирование РМ-системы B.pumilus N4

Штамм Bacillus pumilus N4 - продуцент новой эндонуклеазы рестрикции BpuN4I [3] является малопродуктивным, в связи с чем необходимо было клонировать данный фермент. На первом этапе мы провели выделение хромосомной ДНК из 3 г биомассы B.pumilus N4 и получили 2,8 мг ДНК с концентрацией 0,7 мг/мл. ДНК гидролизовали отдельно рестриктазами MfeI (5’-C^AATTG-3’) и EcoRI (5’-G^AATTC-3’) как описано в разделе «Материалы и методы». Плазмиду pUC19 лианеризовали рестриктазой EcoRI, дефосфорилировали щелочной фосфатазой и сшивали с помощью Т4-ДНК-лигазы со смесью гидролизатов ДНК B.pumilus N4, после чего трансформировали клетки E. coli ER2267 [13] путём электропорации.

В результате трансформации было получено 20 тысяч клонов E. coli, несущих фрагменты ДНК B.pumilus N4 и представляющих библиотеку этого штамма.

 

Отбор рекомбинантных продуцентов рестриктазы BpuN4I

Для выявления штаммов-продуцентов целевого фермента из всего пула трансформантов использовали метод деления (разведения) библиотеки, а также методы селекции клонов-продуцентов рестриктазы по устойчивости к бактериофагу и по устойчивости плазмидной ДНК рекомбинантных клонов к расщеплению рестриктазой.

На первом этапе мы применили метод деления (разведения) полученной библиотеки из 20000 клонов с тестированием эндонуклеазы рестрикции в суммарных лизатах клонов как описано в «Материалах и методах». На рисунке 1 приведены результаты определения активности BpuN4I в последовательных разведениях суммарных лизатов клеток, вплоть до тестирования рестриктазы в отдельных клонах в последнем разведении.

 b_320_200_16777215_00_Pics_paper83-fig1.jpg

 

 

Рис. 1. Определение активности BpuN4I в лизатах клеток, полученных из 103 (а), 102 (б), 10 (в) и из отдельных клонов (г) в процессе выделения продуцента из библиотеки.  Дорожки: 1 – 24 – лизаты клеток + ДНК бактериофага лямбда, М – маркер (ДНК бактериофага лямбда + BssT1I). Электрофорез в 0,8% агарозном геле.

 

 

Из рисунка 1 видно, что при первом разведении активность рестриктазы BpuN4I определяется в суспензии клеток под номером 19 (рис.1а). Суспензию клеток под номером 19 разводили в 10 раз и определяли активность фермента на следующей стадии отбора. Как видно из рисунка 1б, активность проявилась в лизатах 11-ой, 14-ой, 20-ой смесей, содержащих в каждой от 80 до 150 клонов (рис.1б). Суспензию клеток под номером 11 разводили далее и обнаружили активность фермента в смесях под номерами 8 и 19 (рис.1в). На заключительном этапе отбора смесь клеток под номером 8 рассевали до отдельных колоний, в которых тестировали активность рестриктазы BpuN4I (рис.1г). Клон под номером 1 был взят для дальнейшей работы и обозначен как E. coli N41 (pBpuN4/MR).

 

Селекция потенциальных продуцентов по устойчивости к бактериофагу и по устойчивости рекомбинантной плазмиды к рестриктазе BpuN4I

Селекцию по устойчивости к бактериофагу проводили, как описано в разделе «Материалы и методы». При инфицировании со множественностью 8 б.о.е./к.о.е. выжило 0,09% трансформантов. 300 из них пересеяли, однако активности BpuN4I в них обнаружено не было. Таким образом, нам не удалось провести селекцию библиотечных штаммов-продуцентов  BpuN4I по устойчивости к бактериофагу.

Селекция по устойчивости пула рекомбинантных плазмид к рестриктазе BpuN4I дала положительный результат. Суммарную плазмидную ДНК 20 тысяч трансформантов E. coli, представляющих библиотеку ДНК B. pumilus N4, обрабатывали рестриктазой BpuN4I как описано в разделе «Материалы и методы». После чего гидролизатом повторно трансформировали клетки E. coli и получили 20 клонов. Определение в них активности рестриктазы показало наличие фермента BpuN4I в четырнадцати клонах. Выделенные из данных клонов плазмиды проявили устойчивость к BpuN4I, что свидетельствует о наличии в них генов рестриктазы и метилазы РМ-системы BpuN4I. Анализ ДНК плазмид показал, что часть из них идентична ранее полученному клону E. coli N41 (pBpuN4/MR), тогда как остальные плазмиды были одинаковы и содержали фрагмент ДНК с РМ-системой BpuN4I, ориентированный в противоположном направлении. Для дальнейшей работы мы выбрали один клон из второго набора и обозначили его как E. coli N7 (pBpuN4/MR).

Таким образом, селекция полученной библиотеки клонов при помощи предлагаемого метода деления (селекции) с прямым определением активности фермента, а также метода отбора клонов по устойчивости их ДНК к рестриктазе BpuN4I дали положительный результат.

Данные по сравнительному анализу активности фермента BpuN4I в клонах E. coli N41 и E. coli N7 представлены на рисунке 2. Равные количества клеток каждого штамма суспендировали в лизирующем буфере и определяли активность фермента как описано в разделе «Материалы и методы». При этом проводили 2-кратные разбавления лизата в реакционной смеси. Из рисунка 2 видно, что активность BpuN4I в клетках E. coli N41 в два раза выше, чем в E. coli N7.

 b_320_200_16777215_00_Pics_paper83-fig2.jpg

 

Рис. 2. Определение активности BpuN4I в разведениях лизатов клеток рекомбинантных продуцентов. Дорожки: 1 – 2-кратное разбавление клеток культуры в реакционной смеси, 2 – 4-кратное,  3 – 8-и,  4 – 16, 5 – 32, 6 – 64, 7 – 130, 8 – 250, 9 – без лизата, М – маркер длины ДНК (λ ДНК+BssT1I), состоящий из фрагментов 19329, 7743, 6223, 4254, 3472, 2690, 1882, 1489, 925  421  и 74 пар нуклеотидов. Электрофорез в 0,8% агарозном геле.

 

 

Анализ структуры вставки ДНК плазмиды pBpuN4/MRN41

Нами была установлена первичная структура ДНК вставки плазмиды наиболее продуктивного штамма E. coli N41 и полученная нуклеотидная последовательность была депонирована в GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/BpuN4I_RM.sqn BpuN4I_RM KF150199).

На рисунке 3 приведена физическая карта плазмиды pBpuN4/MR N41, которая содержит MfeI-фрагмент ДНК B. pumilus N4, встроенный в вектор pUC19/EcoRI. Длина фрагмента составляет 3495 п.н. Встроенный фрагмент включает протяжённые открытые рамки считывания, направленные в одну сторону. Как показано ниже, одна из этих рамок (1695-3023) представляет ген bpuN4IM, кодирующий ДНК-метилтрансферазу BpuN4I, а другая (624-1646) - ген bpuN4IR , кодирующий эндонуклеазу рестрикции BpuN4I.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper83-fig3.jpg 

 

 

Рис. 3. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pBpuN4/MR N41: ORI – точка начала репликации плазмиды pBpuN4/MR; Apr –  ген BLA, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, P(BLA) – промотор гена BLA; P(LAC) – промотор гена lacZ; bpuN4IR – ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции BpuN4I; bpuN4IM – ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу BpuN4I.

 

 

Рисунок 4 иллюстрирует  результаты множественного выравнивания аминокислотной последовательности первой открытой рамки считывания с реально существующими и наиболее гомологичными белками, оказавшимися ДНК-метилтрансферазами с сайтами узнавания 5’-GGNNCC-3’ или сходными.  Таким образом, первая открытая рамка считывания кодирует фермент ДНК-метилтрансферазу М.BpuN4I.  Анализ аминокислотной последовательности метилазы показал, что М.BpuN4I содержит все десять консервативных мотивов, характерных для цитозин (C5)-ДНК-метилтрансфераз (КФ 2.1.1.73) [14, 15].

b_320_200_16777215_00_Pics_paper83-fig4.jpg

 

 

Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей  M.BpuN4I и наиболее гомологичных по структуре TRD белков.  В выравнивание включены только ДНК-метилтрансферазы с достоверно установленными сайтами узнавания. Район TRD обозначен звездочками.

 

 

 

Ввиду отсутствия во встроенном фрагменте других протяженных рамок считывания, мы сделали вывод, что вторая открытая рамка считывания кодирует ген рестриктазы R.BpuN4I.

На рисунке 5 представлено множественное выравнивание R.BpuN4I и наиболее гомологичных белков. Для гипотетических белков указаны номера GenBank (WP_018195440 - candidate division EM 19 bacterium SCGC AAA471-D06; WP_009413428 - Capnocytophaga sp. oral taxon 326; YP_002378322 - Cyanothece sp. PCC 7424). Звездочками обозначен предположительный каталитический участок ферментов. В отличие от метилазы нам не удалось выявить существенной гомологии рестриктазы BpuN4I с другими эндонуклеазами рестрикции с известным сайтом узнавания, что связано с их большой генетической вариабильностью.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper83-fig5.jpg

 

 

Рис. 5. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей  R.BpuN4I и наиболее гомологичных белков. 

 

 

 

Заключение

РМ-систему рестрикции-модификации BpuN4I (сайт узнавания 5’-GGNNCC-3’) из штамма B. pumilus N4, содержащую уникальный неошизомер рестриктазы NlaIV, клонировали в E. coli. Для отбора рекомбинантных продуцентов рестриктазы нами был предложен метод селекции, основанный на делении (разведении) полученной библиотеки клонов с прямым определением активности эндонуклеазы рестрикции в суммарных лизатах клеток. С помощью предложенного метода был выявлен рекомбинантный штамм E. coli N41(pBpuN4/MR), являющийся продуцентом фермента BpuN4I. Была установлена структура ДНК плазмидной вставки штамма E.coli N41(pBpuN4/MR) и показано, что она содержит гены ДНК-метилтрансферазы M.BpuN4I и эндонуклеазы рестрикции BpuN4I. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности ферментов, кодируемых данными генами, выявил гомологию M.BpuN4I с другими метилазами, узнающими сайт 5’-GGNNCC-3’ или сходный с ним. В аминокислотной последовательности M.BpuN4I выявлены все 10 доменов, характерных для 5мС-ДНК-метилтрансфераз.

 

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации по государственному контракту №14.512.11.0051 от 03.04.2013 г., заключенному в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы».

 

Литература

  1. Roberts R.J., Halford S.E. Type II restriction enzymes // In Nucleases (Linn, S.M., Lloyd, R.S., Roberts, R.J. Ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. – 1993. – P. 35-88.
  2. WilsonG. G., Murray N. E. Restriction and modification systems // Annu. Rev Genet. – 1991. – V. 25. – P. 585-627.
  3. Чернухин В.А., Михненкова Н.А., Ломаковская Е.Н., Шинкаренко Н.М., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнает и расщепляет последовательность ДНК 5’-G^GNNCC-3’ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. – 2013. -. Т. 9. - № 2. – С. 5-8.
  4. Дедков В.С., Погребняк В.Б. Определение эдонуклеаз рестрикции в лизатах из отдельных колоний бактерий и измерение активности BamHI, PstI и MspI у бактерий, выращенных на питательном агаре и в бульоне //  Внехромосомные генетические элементы: значение для науки и практики: 6-е рабочего совещание по программе «Плазмида». Тезисы докладов. – М., 1981. – С. 50 – 51.
  5. Дедков В. С., Дегтярев С.Х. Определение эндонуклеаз рестрикции в колониях микроорганизмов Streptomyces и Nocardia. // Прикл. биохимия и микробиология. – 1992. - Т. 28. – С. 309—313.
  6. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratopy manual / Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA. – 1987.
  7. Smith C.L., Klco S.R. and Cantor C.R. / Davies K. (ed.) // Genome Analysis: A Practical Approach  / IRL Press. – Oxford. UK. –  1987.
  8. Bougueleret L., Schwarzstein M., Tsugita A., Zabeau M. Characterization of the genes coding for the EcoRV restriction and modification system of Escherichia coli // Nucleic Acids Res. - 1984. - V. 12. – P. 3659-3677.
  9. Zhu Z., Pedamallu C.S., Fomenkov A., Benner J., Xu S-Y. Cloning of NruI and Sbo13I restriction and modification system in E.coli and amino acid sequences comparison of M.NruI and M.Sbo13I with other amino-methyltransferases. // BMC Research notes. - 2010. – V. 3. – P. 139.
  10. Szomolányi, E., A. Kiss, and P. Venetianer. 1980. Cloning the modification methylase gene of Bacillus sphaericus R in Escherichia coli. Gene V. 10. – P.219-225.
  11. Morgan R. D., Xu Q. Type II restriction endonuclease, Hpy188I, obtainable from Helicobacter pylori J188 and a process for producing the same // United States Patent 6258583. – 2001.
  12. Morgan R.D., Xu Q. Type II restriction endonuclease, Hpy99I, obtainable from Helicobacter pylori J99 and a process for producing the same // United States Patent 6280992 B. - 2001.
  13. New England BioLabs, Inc. 2000-01 Catalog & Technical Reference / USA. – P. 226-229.
  14. Klimasauskas S., Nelson J.L., Roberts R.J. The sequence specificity domain of cytosine-C5 methylases // Nucleic Acids Res. – 1991. – V. 19. P. 6183–90.
  15. S-Adenosylmethionine-Dependent Methyltransferases: Structures and Functions / Editors: Cheng X., Blumenthal R.M.  –  World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.: Singapore, New Jersey, London, Hong Kong. –  1999.

 

Список сокращений

б.о.е. – бляшку образующая единица (активная частичка бактериофага)

БСА – бычий сывороточный альбумин

е.а. – единицы активности (фермента).

к.о.е. – колонию образующая единица (живая клетка бактерии)

о.е. – оптические единицы плотности.

ПААГ – полиакриламидный гель

п.н. – пары нуклеотидов ДНК.

РМ-системы – системы рестрикции-модификации

SE-буферы – буферы для сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз производства ООО «СибЭнзайм».