Научные статьи // Методы исследования
Клонирование системы рестрикции-модификации BpuN4I из Bacillus Pumilus N4
- Категория: Методы исследования
- Просмотров: 9690
ДНК бактериального штамма Bacillus pumilus N4, несущего систему рестрикции-модификации BpuN4I (сайт узнавания 5’-GGNNCC-3’), гидролизовалась эндонуклеазами рестрикции MfeI и EcoRI и полученные продукты клонировались в вектор pUC19, линеаризованный EcoRI. Для отбора клонов, несущих ген эндонуклеазы рестрикции BpuN4I, было предложено использовать метод селекции, основанный на делении (разведении) полученной библиотеки клонов с прямым определением активности эндонуклеазы рестрикции в суммарных лизатах клеток. С помощью данного метода был выявлен рекомбинантный штамм E. coli N41(pBpuN4/MR), являющийся продуцентом фермента BpuN4I. Также была проведена селекция полученной библиотеки традиционным методом Венецианера и получены два различных клона, один из которых идентичен E. coli N41(pBpuN4/MR), а второй, E. coli N7(pBpuN4/MR), содержит вставку в плазмиде в противоположном направлении и проявляет меньшую активность. Была установлена структура ДНК плазмидной вставки штамма E.coli N41(pBpuN4/M)R и показано, что она содержит гены ДНК-метилтрансферазы M.BpuN4I и эндонуклеазы рестрикции BpuN4I. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности ферментов, кодируемых данными генами, выявил гомологию M.BpuN4I с другими метилазами, узнающими сайт 5’-GGNNCC-3’ или сходный с ним. В аминокислотной последовательности M.BpuN4I выявлены все домены, характерные для 5мС-ДНК-метилтрансфераз.
Читать полный текст статьи Клонирование системы рестрикции-модификации BpuN4I из Bacillus Pumilus N4
Определение эндонуклеаз рестрикции в колониях микроорганизмов Streptomyces и Nocardia
- Категория: Методы исследования
- Просмотров: 5174
Прикладная биохимия и микробиология Том 28, 1992, №. 2, 309- 313
Предложен метод тестирования различных штаммов актиномицетов Streptomyces и Nocardia на наличие эндонуклеаз рестрикции. Тестирование проводилось непосредственно в клетках из колоний с чашки Петри. Собранные клетки обрабатывали лизоцимом и тритоном Х-100, после чего клеточный лизат анализировали на наличие специфической эндонуклеазной активности. Метод позволяет тестировать ферменты NcoI, NotI, NruI, SfiI, Sfr303I в лизатах соответствующих штаммов-продуцентов.
Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции
- Категория: Методы исследования
- Просмотров: 6643
Биоорганическая химия, Т 15, № 3, 1989, С. 358 - 362
Предложен метод аффинной хроматографии эндонуклеаз рестрикции IIS-типа. Показано, что рестриктазы HgaI, FokI, SfaNI избирательно связываются на носителе с иммобилизованным дуплексом (один из олигонуклеотидов которого ковалентно связан с полимерным носителем), содержащим сайты узнавания этих ферментов, но неспособным гидролизоваться ими.
Подробнее: Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции
Выявление штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикций среди водных микроорганизмов озера Байкал
- Категория: Методы исследования
- Просмотров: 5074
Известия СО АН СССР, Серия биол. наук, выпуск 1, 1990, 109 - 113
Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) находят широкое применение в генно-инженерных работах [1, 2], что обусловливает актуальность выявления новых штаммов-продуцентов этих ферментов, являющихся более технологичными, чем известные. Поиск новых штаммов-продуцентов рестриктаз проводится среди микроорганизмов, выделенных из различных природных изолятов. Водные микроорганизмы относительно плохо изучены как возможные продуценты рестриктаз, хотя среди них недавно были выявлены ферменты с новой специфичностью [3, 4]. Целью данной работы явились обнаружение и идентификация новых штаммов-продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов уникальной экологической ниши — оз. Байкал. Изолированность экосистемы Байкала, установленная в настоящее время, обеспечивает благоприятные условия для образования новых видов организмов. Поскольку хорошо известно, что при прочих равных условиях скорость эволюции вида обратно пропорциональна продолжительности генерации [5], то очевидна целесообразность поиска эндемичных видов и, следовательно, продуцентов новых ферментов среди байкальских микроорганизмов, т. е. штаммов, выделенных из пелагиальной части водной толщи и донных отложений.
Модифицированный способ определения места расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции
- Категория: Методы исследования
- Просмотров: 7354
Биотехнология, 1988, том 4, № 5, с 618 - 620
Успехи молекулярной биологии и генетической инженерии во многом определяются наличием широкого ассортимента эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз), список которых ежегодно пополняется новыми наименованиями [1]. Обнаруживаемые ферменты необходимо охарактеризовать как по узнаваемой ими последовательности, так и по месту расщепления цепи ДНК. Идентификация сайта узнавания в настоящее время не представляет проблемы. С этой целью обычно используют совместный гидролиз ДНК изучаемыми ферментами и ферментами известной специфичности [2—4] либо сравнивают экспериментальные данные с предполагаемыми картинами расщепления маркерной ДНК по сайтам узнавания [5—8].