Главная  //  Научные статьи  //  Популярно о  //  Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и ее применение

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и ее применение

 

Охапкина С.С. Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

 

ПЦР - это метод, который позволяет проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации и используется для получения копий непротяженных участков ДНК, специфичных для каждого конкретного наследственного или инфекционного заболевания, а также исследуемого генетически обусловленного признака, и, кроме того, для визуализации (в случае присутствия) таких специфических участков, что и является целью генодиагностики.
В основе метода ПЦР лежит способность хорошо известных в молекулярной биологии ферментов, ДНК-полимераз, осуществлять направленный синтез второй, т.е. комплементарной цепи ДНК, по имеющейся матрице одноцепочечной ДНК, наращивая небольшую олигонуклеотидную затравку (праймер), комплементарную участку этой матрицы, до размеров в несколько тысяч или даже десятков тысяч звеньев. Повышая температуру, можно добиться остановки реакции и последующей денатурации полученной ДНК, т.е. разделения цепей полученной в ходе реакции двуцепочечной ДНК. Если в реакционной смеси присутствует избыток праймера, то, значительно снизив температуру, чтобы праймер мог вновь связаться с тем же самым комплементарным участком ДНК, и добавив новую порцию фермента, можно вновь установить температуру, необходимую для реакции полимеризации, и, таким образом, проведя реакцию еще раз, увеличить количество ранее полученного продукта. Многократное, или как говорят циклическое, повторение этой процедуры позволяет наработать значительное количество копий участка ДНК, начинающегося с данного праймера. Принципы метода были впервые предложены профессором Корана в 1971 году.


Собственно как метод ПЦР возникла, когда в описанном выше процессе стали использовать не просто ДНК-полимеразу, а так называемую термостабильную ДНК-полимеразу, т. е. фермент, способный без ущерба для своей активности переносить временный высокотемпературный нагрев реакционной смеси, необходимый для денатурации ДНК. Это позволило проводить реакцию копирования ДНК без добавления свежей порции фермента после каждого цикла и использовать для работы специальные приборы-термостаты с меняющимися температурно-временными режимами - так называемые термоциклеры или амплификаторы ДНК. Широкомасштабное применение метода ПЦР в практической деятельности началось, когда производство обеспечило доступность термостабильных ферментов для потребителей.
Каждый цикл ПЦР состоит из трех этапов, суть которых описана ниже.
На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего двуцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. На втором этапе происходит отжиг (присоединение праймеров к ДНК-мишени с образованием коротких двухцепочечных участков ДНК, необходимых для инициации синтеза ДНК). Для обеспечения этого процесса праймеры берутся в избытке по отношению к матрице. С образовавшимися комплексами праймер-матрица связывается ДНК-полимераза и на третьем этапе происходит одновременное копирование ДНК с двух праймеров комплементарных участкам ДНК на противоположных цепях и расположенных таким образом, что полимеризация ДНК с одного праймера приводила к синтезу цепи ДНК, в которой на определенном удалении содержался участок ДНК, комплементарный другому праймеру (рис. 1.) .
Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Принципиально, что синтезированные в ходе первого цикла

b_320_200_16777215_00_Pics_paper8_fig1.gif

 

ПЦР цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента нуклеиновой кислоты генома вируса, бактерий или человека. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза все новых и новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в реакционном растворе, теоретически в геометрической прогрессии по формуле:


Nf = N0(1+Y) n,


где n-число циклов амплификации, N0 –начальное количество копий гена, Nf - конечное количество копий гена, Y – коэффициент эффективности работы ДНК-полимеразы в цикле.
Даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в синтезируется столько молекул ампликона, что их концентрация достигает 10-20 мкг/мл. Этого количества достаточно для достоверного визуального обнаружения продукта ПЦР методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле после соответствующего окрашивания. Специфичность синтезированного фрагмента ДНК подтверждается по результатам электрофореза по его положению (размерами) относительно маркерных образцов рестрицированных плазмид или положительного ДНК-контроля (дополнительные доказательства специфичности ампликона получают при разработке тест-систем методами рестрикционного анализа, гибридизации и прямого секвенирования).
В конечном итоге ПЦР позволяет многократно копировать любой выбранный фрагмент геномной ДНК. При проведении ПЦР наиболее часто используется термостабильная ДНК-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus, сокращенно называемая Taq ДНК-полимераза, температурный оптимум работы которой находится в области 70-72°С. В подавляющем большинстве случаев ампликоны длиной до 4-6 тыс. пар нуклеотидов получают с использованием именно Taq ДНК-полимеразы. Вероятность неточного включения нуклеотида при этом находится на уровне 0,01-0,001 %. Уровень ошибок является критическим моментом в некоторых технологиях применения ПЦР. Необходимость в уменьшении частоты возникновения ошибок стимулирует поиски новых ( либо модификации при помощи генной инженерии известных ) термостабильных ДНК-полимераз, амплифицирующих ДНК с большей точностью. Vent ДНК-полимеразу (а также другие ДНК-полимеразы, отличающиеся наличием так называемой корректирующей активности, например, Pwo, Pfu, Tgo, Ultma) применяют для достижения более точного копирования а также для получения продуктов длиной порядка 10 тыс.пар нуклеотидов (как в случае с TaqSE ДНК-полимеразой). И все же на сегодняшний день уровень ошибки ДНК- полимераз менее 0,00001% остается недостижимым. Для секвенирования с использованием ПЦР применяют генноинженерный вариант Taq ДНК-полимеразы со значительно увеличенным сродством фермента к дидезоксинуклеозидтрифосфатам. При необходимости клонирования ампликонов целесообразно применить Т4 ДНК-полимеразу из штамма Е.coli, несущего рекомбинантную плазмиду с геном ДНК-полимеразы из бактериофага Т4 и/или фрагмент Кленова для удаления 3'- выступающих или заполнения 3'- «спрятанных» концов ДНК. Для этой же цели можно использовать Vent ДНК-полимеразу из Thermococcus litoralis. Использование способности Vent ДНК-полимеразы расплетать ДНК-дуплекс на пути следования полимеразы при температурах выше 55°C - обеспечивает дополнительные возможности при проведении ПЦР.
Для ПЦР РНК-содержащих проб предварительно проводят стадию обратной транскрипции - получения ДНК, комплементарной РНК-матрице, для чего используют специфические праймеры к РНК и фермент РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу, ревертазу). Для этого используют иногда свойство Tth ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus осуществлять в особых условиях реакцию обратной транскрибции, но чаще для синтеза первой цепи кДНК применяют рекомбинантную M-MuLV обратную транскриптазу, у которой отсутствует активность РНКазы Н, что дает возможность получать более длинные продукты. Далее ПЦР проводят по схеме, описанной выше.
Специфичность и эффективность синтеза копий нуклеиновых кислот в ходе ПЦР зависят не только от качества и свойств ДНК-полимеразы. Огромное значение придается и качеству других компонентов реакционной смеси. Рассмотрим основные из них.
ДНК-матрица. Образец ДНК используемый в ПЦР должен содержать по меньшей мере одну полноразмерную интактную копию исследуемой нуклеотидной последовательности. Большее число целевых копий повышает вероятность успешной амплификации. Наличие однонитевых разрывов в целевой ДНК блокирует амплификацию. Целевая последовательность может быть длиной от нескольких десятков до нескольких десятков тысяч нуклеотидов. Для проведения ПЦР обычно используют 0,1-1 мкг геномной ДНК млекопитающих, 10-100 нг, 1-10 нг и 0,1-1 нг дрожжевой, бактериальной и плазмидной ДНК соответственно. ДНК-матрица, содержащая целевую последовательность, может вноситься в ПЦР как в денатурированном, так и в нативном состоянии. Поскольку эффективность ПЦР выше при использовании линейных молекул ДНК, амплификация может быть облегчена обработкой матрицы такими эндонуклеазами рестрикции, которые заведомо не гидролизуют структуру целевой последовательности. Раствор с ДНК-матрицей, после выделения ее из клинических образцов, не должен содержать примесей ЭДТА в концентрации более 1мМ, а так же таких отрицательно заряженных ионов, как РО43- .
Праймеры. Разработка структуры олигонуклеотидных праймеров для ПЦР является ответственейшим элементом, как в научно-исследовательской работе, так и при создании любого диагностического набора. Требуется подобрать фрагмент молекулы ДНК таким образом, чтобы два его концевых участка, находящиеся на расстоянии 300–10000 нуклеотидов друг от друга (для удобной детекции), отличались бы по своей структуре генетической консервативностью и присутствовали только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене человека и, в тоже время, отсутствовали в ДНК других возбудителей болезней или других генах человека. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы, использующие информацию о нуклеотидной последовательности известных микроорганизмов или генов человека. Получить подобную информацию можно из международных компьютерных банков данных GenBank, EMBL.
Длина олигонуклеотидных праймеров обычно составляет 20-30 нуклеотидов. Место комплементарного присоединения праймеров к ДНК-матрице не должно находиться внутри стабильной шпилечной структуры (которая возникает при наличии протяженных инвертированных повторов) или рядом с ней. На 3'-конце праймеров лучше не оставлять подряд более трех G или C. Следует исключить комплементарность 3'-концов праймеров друг другу. По возможности содержание (G + C) в структуре праймерах выбирают в интервале 50-60 %, что создает предпосылки для высокой температуры отжига. В сравнении праймеров между собой разница в длине несущественна при условии соблюдения равенства температур плавления Tm (диапазон разброса не более 2oC). Для определения Tm достаточно воспользоваться простым правилом:


Tm = [2( a + t ) + 4( g + c)] oC


Несмотря на то, что расчет по данной формуле дает завышенные значения, т.к. формула предназначена для коротких (до 20 нуклеотидов) праймеров, можно не использовать для вычислений более сложные формулы, поскольку реальная температура отжига Tа праймеров ниже Tm на 5-10°C и зависит от многих факторов. Сам же синтез праймера по заданной последовательности нуклеотидов не представляет особой технической сложности и осуществляется на автоматических синтезаторах.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. В стандартной ПЦР в качестве «строительного материала» для синтеза комплементарных цепей используют дезоксиаденозинтрифосфат, дезоксигуанозинтрифосфат, дезоксицитозинтрифосфат и тимидинтрифосфат. Водные растворы этих дНТФ (рН 7-8) хранят замороженном состоянии при -20°C. Рабочие растворы дНТФ готовят в концентрации 0,5–10 мМ путем разбавления растворов хранения стерильной бидистиллированнной или деионизованной водой. В зависимости от выбранного фермента в ПЦР используют различные концентрации дНТФ, что напрямую связано с кинетическими параметрами полимераз. Например, для работы Vent ДНК-полимеразы требуется 0,2 мМ концентрация каждого из четырех используемых дНТФ, в то время как для эффективной работы Taq ДНК-полимеразы достаточно 50 мкM каждого дНТФ (теоретически обеспечивает уже при 20%-ном включении синтез в 100 мкл реакционной смеси 1,3 мкг ДНК, что соответствует 5 пикомолям ампликона длиной 400 пар нуклеотидов). Интервал концентраций 20-200 мкM выбирают для установления оптимального баланса между эффективностью, специфичностью и точностью работы ДНК-полимераз. Например, точность уменьшается при концентрации дНТФ много меньше константы Михаэлиса, либо когда концентрация одного из дНТФ ниже по сравнению с остальными тремя. Избыток дНТФ может приводить к снижению специфичности и эффективности, особенно при несоответствующей концентрации Mg2+ . В нестандартных ПЦР могут использоваться с различной эффективностью модифицированные, в том числе флуоресцентно-меченные субстраты.
Ионы двухвалентных металлов. Ионы Mg2+ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы в ПЦР. Многие компоненты реакционной смеси связывают эти ионы, в том числе ДНК-матрица, праймеры, ампликоны и дНТФ. Поэтому, чтобы определить и создать оптимальный избыток несвязанного иона в рамках 0,5-2,5 мМ, проводится оптимизация для выбранных концентраций ДНК-матрицы, праймера, дНТФ и ДНК-полимеразы путем изменения концентрации ионов в интервале 1-4 мМ (в специальных случаях до 10мМ) с шагом 0,2-0,5 мМ. В стандартной ПЦР используются концентрации в пределах 1,5-2 мМ Mg2+. В зависимости от типа используемого реакционного буфера ионы вносят в виде хлорида, сульфата или ацетата. Ионы Mn2+ приводят к снижению точности копирования и потому добавляются при проведении сайт-направленного мутагенеза.
Реакционный буфер. В стандартной ПЦР используется солевые буферы на основе 10-70 мМ Трис-HCl рН 8-9(20oC). Вследствие значительной зависимости рН этого буфера от температуры: рКа /10oC – 0,31, в протоколах по получению продуктов длиной более 10 т.п.н. используют Трицин-КОН буфер рН 9,2.
Активаторы ПЦР. Соли хлорид калия в концентрации 10-50 мМ и/или сульфат аммония в концентрации 10-20 мМ добавляют для улучшения отжига праймера. Бычий сывороточный альбумин или желатин в концентрации 0,01 –0,1 % (вес/объем) а также неионные детергенты Triton X100, Nonidet NP40 и Tween 20 в концентрации 0,05-0,1 % (объем/объем) являются стабилизаторами фермента.
Диметилсульфоксид в концентрации 1-10 % (объем/объем), 5%-ный (объем/объем) ацетамид и глицерин в концентрации 5-20 % (объем/объем) могут в некоторых случаях улучшать специфичность. Глицерин способствует повышению термостабильности Taq ДНК-полимеразы. Формамид в концентрации 1-10 % (объем/объем) полезен при копировании G/C богатых матриц.
Ингибиторы. ПЦР может ингибироваться примесями нуклеаз и протеаз; фенолом и хлороформом; полисахаридами, в особенности гепарином; лидирующими красителями (креазоловым красным, бромфеноловым синим, ксиленцианолом); додецилсульфатом натрия и этилендиаминтетрауксусной кислотой, а также ионами тяжелых металлов.
Первичная высокотемпературная денатурация геномной ДНК проводится в течение 3-10 мин и зависит от типа матрицы. Однако оптимальным временем денатурации считается 4-5 мин. Выбор временных интервалов и температурного режима зависит в значительной степени от состава реакционной смеси ПЦР, типа используемых пробирок и модели амплификатора и в каждом конкретном случае может значительно отличаться от так называемых «стандартных условий» - 94°C 1 мин., 55°C 1 мин., 72°C 1 мин. В присутствии органических добавок полная денатурация матрицы может быть достигнута уже при температурах ниже 90?C. При использовании, например, такого термостабильного фермента, как Vent ДНК-полимераза, температуру денатурации можно повышать до 97°C.
Время отжига может составлять всего несколько секунд, если амплификатор настроен на измерение температуры образца, а не термоблока. При использовании же праймеров, не полностью комплементарных матрице, первые циклы ПЦР проводят при меньшей температуре отжига по сравнению с последующими циклами.
Время и температура синтеза зависит не только от активности полимеразы но и от солевого состава реакционного буфера и природы ДНК-матрицы. В целом же можно руководствоваться соотношением 1 мин. синтеза на каждую тысячу пар нуклеотидов ампликона. На последнем цикле ПЦР время синтеза устанавливается в 2-3 раза большее, что обеспечивает завершение синтеза на недостроенных 3'-концах продуктов ПЦР.
Для предотвращения испарения реакционной смеси поверх нее наслаивают (кроме амплификаторов с нагреваемой крышкой) минеральное масло, либо специальные парафин или воск.
Для повышения специфичности ПЦР используют технику так называемого горячего старта, суть которого заключается в добавлении (либо активации) фермента в пробирку с реакционной смесью только после проведения первой денатурации.
В целях оптимизации выхода продукта ПЦР в условиях неопределенности с температурой отжига праймеров используют процедуру «скатывания», когда температура отжига уменьшается постепенно цикл за циклом и суммарная ее разница может составлять 15-20°C. В последнее время появились модели термоциклеров с градиентными температурными платами, позволяющими значительно облегчить подбор температуры отжига праймеров.
Для решения одной из проблем «контаминации» - загрязнения ампликонами, успешно используется добавление дезоксиуридинтрифосфата, с применением в последующих ПЦР фермента урацил-ДНК-гликозилазы, который удаляет урацил из ампликонов, делая их, таким образом, непригодными в качестве матрицы для работы ДНК-полимеразы. На стадии первичной денатурации урацил-ДНК-гликозилаза инактивируется и не мешает проведению ПЦР .
В исследовательских, а в последнее время и в практических целях применяется ПЦР в режиме реального времени, что позволяет получать данные о кинетике ПЦР . Для этого используется амплификатор, снабженный флуориметром. Синтезируется олигонуклеотид, комплементарный последовательности целевой ДНК, на 5'-конце которого находится нуклеотид, несущий флуоресцентную группу, а соединение, гасящее флуоресценцию, расположено на блокированном 3'-конце,что делает его неспособным выполнять роль праймера. Когда Taq ДНК-полимераза за счет своей внутренней 5'-3' экзонуклеазной активности высвобождает 5'-концевой нуклеотид, флуоресценция не гасится и детектируется флуориметром. С использованием кинетических данных вычисляется (при помощи соответствующего программного обеспечения) исходная концентрация целевой ДНК в анализируемой пробе (что может использоваться для определения инфекционного агента) и получают количественные характеристики экспрессии генов.
Полимеразная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом молекулярной биологии, молекулярной генетики и клинической лабораторной диагностики, позволяющим выявлять в тканях и биологических жидкостях организма единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний, выявлять и идентифицировать даже однонуклеотидные изменения в структуре генов. Таким образом, основным достоинством метода ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность этого молекулярно-биологического исследования. Используемые в медицинской практике тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют сегодня обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим) их выявление невозможно (вследствие разницы в чувствительности в 1-2 порядка ). Возможности, заложенные в методе ПЦР, позволяют, с одной стороны, достигать максимальной специфичности анализа, т.е. способности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. С другой стороны, соответствующий выбор олигонуклеотидных праймеров, в основном определяющих специфичность анализа, позволяет одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.
Другим достоинством метода является то, что для ПЦР-диагностики практически всех инфекционных заболеваний, а также наследственных заболеваний человека, может быть использован один набор оборудования, универсальные процедуры пробо-подготовки и постановки анализа, а также однотипные (отличающиеся в основном структурой праймеров) наборы реактивов. Для проведения ПЦР-анализа не требуется проведение культуральных и микробиологических процедур, что раньше занимало большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полное исследование в течение 4-4,5 часов.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно-культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также крайне эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва), и в продуктах питания.
Высокая чувствительность и специфичность, непосредственное обнаружение инфекционного агента и возможность проведения генотипирования любого гена человека определяют широкую область применения метода ПЦР в клинической диагностике и медицинской практике.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия.- 1980.- T. 45.- C. 644-651.
  2. Birch D. E., Kolmodin L., Laird W. J. et al. // Nature.- 1996.- V. 381.- P. 445-446.
  3. Don R. H., Cox P. T., Wainwright B. J. et al. // Nucl. Acids Res.- 1991.- V. 19.- P. 4008.
  4. Good N. E. // Biochemistry.- 1986.- V. 5.- P. 467-476
  5. Holland P. M., Abramson R. D., Watson R., Gelfand D. H. // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1991.- V. 88.- P. 7276-7280.
  6. Keohavong P., Wang C. C., Cha R. S., Thilly W. G. // Gene.- 1988. V. 71.- P. 211-216.
  7. Kleppe K., Ohtsuka E., Kleppe R. et al. // J. Mol. Biol.- 1971.- V. 56.- P. 341-361.
  8. Kong H., Kucera R. B., Jack W. E. // J. Biol. Chem..- 1993.- V. 268.- P. 1965-1975.
  9. Lawyer F. C., Stoffel S., Saiki R. K. et. al. // J. Biol. Chem.- 1989.- V. 264.- P 6427-6437.
  10. Longo M. C., Berninger M. S., Hartley J. L. // Gene.- 1990.- V. 93.- P. 125-128.
  11. Rychlik W., Spencer W. J., Rhoads R. E. // Nucl. Acids Res.- 1990.- V. 18.- P. 6409-6412.
  12. Saiki R. K., Scharf S. J., Faloona F. et al. // Science. 1985.- V. 230.- P. 1350-1354.
  13. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S. et al. // Science.- 1988.- V. 239.- P. 487-489.
  14. Sambrook J., Russel D. W. Molecular Cloning, 3rd ed / CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.