Эндонуклеазы рестрикции и их применение

 

Томилова Ю.Э., Дегтярев С.Х.

 

Системы рестрикции-модификации (Р-М системы) широко распространены среди микроорганизмов. В бактериальную Р-М систему входят два специфичных для каждого штамма фермента - ДНК модифицирующий (метилаза) и ДНК расщепляющий (эндонуклеаза рестрикции - рестриктаза). Эти два фермента способны специфически связываться с одной и той же последовательностью ДНК длиной 4-8 пар оснований, называемой сайтом узнавания и характерной для каждого конкретного микроорганизма. При этом метилаза, модифицируя определенный нуклеотид в пределах сайта узнавания, защищает внутриклеточную ДНК от действия рестриктазы. В свою очередь, эндонуклеазы рестрикции являются сайт-специфическими дезоксирибонуклеазами (ЕС 3.1.21.4), взаимодействующими, как сказано выше, со строго определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте участка узнавания или рядом с ним.
За последние 30 лет, прошедших с момента выделения первых эндонуклеаз, из различных штаммов микроорганизмов были получены ферменты, различающиеся между собой по структурной организации, субстратной специфичности и потребности к кофакторам. Все эти ферменты являются одним из главных инструментов генных инженеров, лежат в основе физического картирования и анализа последовательности нуклеотидов в ДНК.


Стремительный рост числа обнаруженных ферментов рестрикции, накопление данных об их структурных и функциональных особенностях вызвал необходимость ввести единую номенклатуру и классификацию. Действующую в настоящее время номенклатуру предложили Смит и Натанс. Она основана на следующих правилах:
Название рода и вида микроорганизма обозначается тремя латинскими буквами (например, Escherichia coli - Eco или Bacillus stearothermophilus - Bst);
За родо-видовым названием следует обозначение штамма (EcoR, BstEN);
Если штамм содержит несколько различных систем рестрикции модификации, то они обозначаются римскими цифрами (Dra I, Dra III; BstEN I, BstEN II).
На основании субъединичной структуры, потребности в кофакторах и некоторых других критериев все эндонуклеазы были разделены на три типа. Здесь мы рассматриваем только рестриктазы II типа, поскольку они устроены наиболее просто и нашли широкое применение в практике. Их высокая специфичность предопределила широкое использование этих ферментов в качестве аналитических реагентов в научных и прикладных диагностических исследованиях, в той или иной мере связанных с изучением структуры ДНК.
Основными характеристиками всех рестриктаз, являются: узнаваемая последовательность нуклеотидов; место расщепления и зависимость активности от наличия метилированых оснований в пределах узнаваемой последовательности. В настоящее время охарактеризована субстратная специфичность около трех с половиной тысяч рестриктаз. Среди них имеются лишь 238 ферментов, узнающих уникальные нуклеотидные последовательности (прототипы). Остальные же эндонуклеазы, открытые позднее, узнают участки ДНК, идентичные уже известным прототипам и входят в группу, так называемых, изошизомеров. Единственный в России производитель рестриктаз НПО "СибЭнзим" может предложить более 170 различных по специфичности эндонуклеаз рестрикции, а также несколько отличающихся по свойствам изошизомеров.
Уникальные последовательности нуклеотидов, являющиеся субстратом для рестриктаз, характеризуются большим разнообразием первичной структуры. Однако для них характерны и некоторые общие черты. Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющихся палиндромами - обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями нуклеотидов в направлении 5'->3' на комплементарных цепях ДНК) (рис.1а).
Сайты узнавания некоторых рестриктаз состоят из нечетного числа нуклеотидов (5 или 7 нуклеотидных пар). За исключением центрального нуклеотида, остальные основания в таких участках также образуют палиндромные последовательности (рис.1б).


5'-AGCT-3'
3'-TCGA-5'
Alu I

5'-AATATT-3'
3'-TTATAA-5'
Ssp I

5'-CCTGCAGG-3'
3'-GGACGTCC-5'
Sbf I

а.

5'-GGWCC-3'
3'-CCWGG-5'
Bme18 I

5'-ACCWGGT-3'
3'-TGGWCCA-5'
Mab I

б.



Рис. 1. Палиндромные сайты с четным (а) и нечетным (б) числом нуклеотидов (W=А или Т).

Нередко узнаваемая последовательность нуклеотидов является прерванной - палиндромные участки разделены какими то нуклеотидными парами, число которых в каждом конкретном случае является строго определенным (рис.2).


5'-ACNGT-3'
3'-TGNCA-5'
Bst4C I

5'-GGNNCC-3'
3'-CCNNGG-5'
PspN4 I

5'-GACNNNGTC-3'
3'-CTGNNNCAG-3'
Tth111 I

5'-GACNNNNGTC-3'
3'-CTGNNNNCAG-5'
BstPA I

5'-GACNNNNNGTC-3'
3'-CTGNNNNNCAG-5'
NruG I

5'-GACNNNNNNGTC-3'
3'-CTGNNNNNNCAG-5'
DseD I



Рис. 2. Прерванные сайты узнавания.


Разнообразие типов сайтов рестрикции, дополняют "вырожденные" палиндромы, в определенных позициях которых присутствуют альтернативные основания (рис.3).


5'-CMGCKG-3'
3'-GKCGMC-5'
MspA I

5'-GRGCYC-3'
3'-CYCGRG-5'
BstAC I

5'-CCSGG-3'
3'-GGSCC-5'
AsuC2 I



Рис. 3. Вырожденные палиндромы, где M=A или C; K=G или T; R=A или G; Y=T или C; S=G или C.

Среди охарактеризованных специфических эндонуклеаз рестрикции имеется группа ферментов узнающих и асимметричные последовательности нуклеотидов (рис.4).


5'-GGTCTC-3'
3'-CCAGAG-5'
Bso31 I

5'-GGATC-3'
3'-CCTAG-5'
AclW I

5'-CCCGC-3'
3'-GGGCG-5'
Fau I



Рис. 4. Асимметричные сайты узнавания.

НПО "СибЭнзим" представляет на своем сайте программу, с помощью которой Вы можете подобрать эндонуклеазу рестрикции для расщепления ДНК по выбранной Вами последовательности нуклеотидов.
Еще одним свойством рестриктаз, имеющим непосредственное отношение к структуре узнаваемых участков и значимым при диагностическом использовании является способность снижать субстратную специфичность, т.е. производить расщепление ДНК в участках, отличающихся по структуре от канонического сайта рестрикции фермента. Пониженная субстратная специфичность ("звездочная" активность) проявляется при определенных условиях проведения реакции. В первую очередь - при использовании избытков рестриктаз. Изменение рН и ионной силы инкубационной среды, замена ионов магния на некоторые другие ионы двухвалентных металлов, добавление органических растворителей (глицерин, диметилсульфоксид, этанол и др.) так же способны стимулировать проявление "звездочной" активности рестриктаз.
Важной функциональной характеристикой рестриктаз является место расщепления двухцепочечной ДНК в узнаваемом участке. Более половины специфических эндонуклеаз расщепляют ДНК внутри участка узнавания. При этом могут образовываться концы цепей трех структурных типов. Если разрыв происходит посередине сайта рестрикции, то образуются фрагменты с полностью спаренными ("тупыми") концами. Когда расщепление ДНК происходит в стороне от середины сайта, образуются выступающие однонитевые концы, получившие название "липких", т.е. способных "слипаться" с комплементарным концом, образующимся в противоположной цепи в результате ее разрыва. При расщеплении одними рестриктазами образуются фрагменты с 5'-выступающими липкими концами. Другие же рестриктазы дают фрагменты с 3'-избыточностью (рис.5). Число нуклеотидов в однонитевом концевом участке может варьировать от одного до пяти.


5'-TTT^AAA-3'
3'-AAA^TTT-5'
Тупые концы

5'-G^AATTC-3'
3'-CTTAA^G-5'
5'-липкие концы

5'-GACGT^C-3'
3'-C^TGCAG-5'
3'-липкие концы



Рис. 5. Способы расщепления ДНК.

Вариации расщепления участков узнавания внесли некоторые поправки и в понятие изошизомерии. Были выявлены рестриктазы, узнающие идентичные сайты, но различающиеся по месту их расщепления. Например, рестриктазы Sma I и Xma I узнают одинаковые последовательности нуклеотидов (CCCGGG), но первая из них при разрыве ДНК образует фрагменты с тупыми концами, а вторая расщепляет узнаваемый участок с образованием 5'-выступающих тетрануклеотидных концов (рис.6). Такие изошизомеры было предложено называть неошизомерами. Также существуют рестриктазы, которые расщепляют ДНК за пределами узнаваемых участков. Почти все они узнают несимметричные последовательности нуклеотидов. Расстояние точки разрыва от узнаваемого участка, а также ее ориентация являются строго определенными для каждой рестриктазы (Рис.7).


5'-CCC^GGG-3'
3'-GGG^CCC-5'
SmaI

5'-C^CCGGG-3'
3'-GGGCC^C-5'
XmaI



Рис. 6. Неошизомеры SmaI и XmaI.


5'-GGTCTCN^N-3'
3'-CCAGAGNNNNN^N-5'
Bso31 I

5'-CCCGCNNNN^N-3'
3'-GGGCGNNNNNN^N-5'
Fau I



Рис. 7. Расщепление ДНК в несимметричных сайтах

Метилирование оснований в узнаваемой последовательности нуклеотидов способно предотвратить ее расщепление рестриктазой. Изошизомеры зачастую отличаются по чувствительности к метилированию. Так, например производимый в НПО "СибЭнзим" фермент Kzo9I (изошизомер Mbo I), узнающий последовательность GATC, не чувствителен к dam метилированию (метилирован аденин) и свободно расщепляет модифицированный субстрат, в то время как еще один изошизомер того же прототипа BstEN II, чувствителен к dam метилированию и не расщепляет модифицированный субстрат.
Эндонуклеазы рестрикции выделяют из биомассы исходных штаммов-продуцентов путем многостадийной колоночной хроматографии клеточного экстракта, пользуясь различными сорбентами. Процедура выделения достаточно сложна и чувствительна ко многим внешним факторам. Вследствие чего, чрезвычайно сложно получить две партии фермента с абсолютно одинаковой концентрацией (концентрация может существенно отличаться).
Полученный чистый белок концентрируют, тестируют и хранят в 50% растворе глицерина. Как и многие другие белковые растворы чистые препараты рестриктаз разрушаются и теряют активность при комнатной температуре, поэтому их необходимо хранить при температуре не выше -180С, а транспортировать и использовать в лабораторных условиях только во льду. При работе пробирку с ферментом необходимо держать за верхнюю часть, чтобы не нагревать фермент пальцами. Кроме того ферменты чрезвычайно чувствительны к загрязнениям, и, чтобы избежать контаминации или инактивации работать с ними необходимо с применением одноразовой пластиковой посуды.
Срок жизни (сохранение активности и специфичности гидролиза) большинства ферментов не превышает одного года. Поэтому использовать их после истечения гарантийного срока, указываемого производителем на упаковке, не рекомендуется. Установлено, что чем меньше (по отношению к общему объему прорбирки) объем раствора фермента, тем быстрее он окисляется и портится. В связи с этим рекомендуется каждый раз перед использованием фасовки фермента стряхивать в охлаждаемой центрифуге капли со стенок пробирки на ее дно (но не более 1 минуты). При необходимости разведения фермента (например, из-за его высокой концентрации), это следует делать непосредственно перед применением ресриктазы и исключительно с использованием специального буфера, поставляемого производителем. Исследователь должен помнить, что в разбавленном виде большинство ферментов чрезвычайно плохо хранятся и сохраняют свою активность на протяжении короткого периода времени.
Активность ферментов проверяют на различных субстратах (в зависимости от наличия в них специфичных сайтов рестрикции). В большинстве случаев используется ДНК бактериофага Лямбда, но, при отсутствии сайтов узнавания для какого-либо фермента в этом субстрате, может использоваться ДНК бактериофага Т7. Если же фермент узнает в контрольной ДНК лишь один уникальный сайт, то для определения активности рестриктазы и лучшей визуализации результатов используется ДНК, предварительно гидролизованная каким-либо крупнощепящим ферментом. В случае некоторых рестриктаз бывает сложно добиться полного гидролиза на таких крупных ДНК, какие были приведены выше (около и более 40 тысяч пар оснований), в этих случаях используют более мелкие молекулы кольцевых плазмидных ДНК, выделяемых из некоторых штаммов бактерии E.coli.
За одну единицу активности эндонуклеазы рестрикции принимают количество фермента, необходимое для полного гидролиза в течении одного часа одного микрограмма ДНК при оптимальной температуре и в оптимальном реакционном буфере. Качество и полнота гидролиза проверяются методом электрофореза в полиакриламидных и агарозных гелях. Многие рестриктазы лучше работают при повышенной температуре, до 650С, и относятся к группе термофильных. Зачастую эти ферменты при температуре инкубации 370С существенно снижают активность вплоть до полной ее потери.
Из-за различий в потребностях в солях, разные ферменты тестируются в разных буферах. В НПО "СибЭнзим" для выявления оптимального буфера, как правило, исходно используется стандартная система из пяти буферных растворов. Все они содержат одинаковую концентрацию соли магния, необходимого для работы любой эндонуклеазы рестрикции, но существенно различаются по наличию и концентрации других солей. При этом иногда возникают ситуации, когда бывший ранее оптимальным буфер заменяется на другой (как правило не входящий в пятерку стандартных, а отличающийся по каким-либо параметрам) на том основании, что в новом буфере фермент демонстрирует более высокую активность. Это позволяет косвенно увеличить концентрацию фермента, что весьма немаловажно при проведении диагностического исследования. Некоторым ферментам для работы необходим SAM (S-аденозилметионин), в этом случае он добавляется в реакционную смесь непосредственно перед реакцией.
Часто бывает необходимо проводить гидролиз одной и той же ДНК двумя различными ферментами одновременно. Для этого производитель предоставляет информацию об относительной активности каждого фермента в различных буферах (в процентах от активности в оптимальном буфере). Пользуясь этими данными можно выбрать буфер в котором активность обоих ферментов не менее 50% и использовать его для совместного гидролиза.
Чистоту фермента проверяют с использованием трех основных тестов. Первый тест на наличие неспецифических эндонуклеаз заключается в избыточном (5-100 кратный избыток) гидролизе ДНК в течение 16 часов. Если электрофоретическая картина такого гидролиза остается характерной для данного фермента, считается что неспецифические эндонуклеазы отсутствуют (рис.8).
Тест рестрикция-сшивка-рестрикция широко используется для выявления наличия примесей неспецифичных эндонуклеаз и фосфатаз. Если эти ферменты присутствуют в реакционной смеси, то они нарушают концевую нуклеотидную структуру фрагментов, образовавшихся при гидролизе ДНК рестриктазой, что делает невозможным в дальнейшем сшивку фрагментов ДНК лигазой и/или их повторное расщепление анализируемой эндонуклеазой рестрикции. Поэтому тест рестрикция-лигирование-рестрикция является очень важным при выявлении примесей неспецифических эндонуклеаз и фосфатаз (Рис.9). Также подобные примеси могут быть выявлены при длительном (3 часа и более) инкубировании рестриктазы с меченой по 5'-концу синтетической олигонуклеотидной последовательностью и последующим электрофорезом образца в денатурирующем полиакриламидном геле (Рис.10).
Еще одной важной технической характеристикой фермента указываемой производителем является его термостабильность. Часто возникает необходимость в инактивации фермента для дальнейших манипуляций и самым простым способом является температурная инактивация в течение 20 минут. При этом если некоторым ферментам достаточно 650С чтобы полностью утратить активность, то другие необходимо прогревать до 800С.
В медицинской генодиагностике эндонуклеазы рестрикции часто используются для гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Многие рестриктазы бывают чувствительны к некоторым компонентам реакционной смеси ПЦР и не расщепляют ДНК вовсе или частично в рекомендованных условиях. Для этого рекомендуется очищать продукты реакции амплификации перед гидролизом рестриктазой либо подбирать другие оптимальные условия реакции. При этом увеличение количества фермента свыше 10% реакционной смеси не рекомендуется в связи с возможностью возникновения "звездочной" активности из-за избытка глицерина.
Рестриктазы, наряду с их значимостью для научных экспериментов, имеют огромное практическое значение, поскольку являются незаменимым инструментом молекулярных генетиков при выполнении диагностических исследований.
Благодаря своим свойствам, каждая рестриктаза узнает свой строго специфичный сайт. При использовании для рестрикции нескольких эндонуклеаз и последующего анализа электрофоретических картин гидролиза можно добиться полного упорядочивания расположения сайтов рестрикции друг относительно друга и создавать таким образом карты исследуемых участков ДНК. Такая информация в дальнейшем используется для выявления различных мутаций. Если в структуре любого из сайтов произойдет изменение (мутация) даже одного нуклеотида, то этот сайт не будет узнаваться рестриктазой и разрезаться, вследствие чего картина гидролиза на электрофорезе изменится. Помимо "исчезновения" сайта узнавания для определенных рестриктаз, в некоторых случаях вследствие мутации в гене может возникнуть дополнительный сайт для рестриктаз, что позволяет легко идентифицировать такую мутацию при проведении гидролиза продукта ПЦР и последующего гель-электрофореза реакционной смеси.
При гидролизе ДНК известной последовательности конкретным ферментом наблюдается строго специфичная (по набору и размеру фрагментов) картина электрофореза. Зная ее, возможно выявление коротких делеции в структуре генов поскольку некоторые фрагменты либо изменяют свою длину, либо вообще исчезают.
Кроме того, немаловажным областью применения рестриктаз является клонирование. Крупные молекулы геномных ДНК фрагментируются различными рестриктазами и, благодаря образованию липких концов, могут быть встроены в небольшие молекулы-вектора с комплементарными липкими концами. Таким образом получают геномные библиотеки, которые могут быть использованы в различных целях.
В настоящее время, как уже отмечалось, в мире известно 238 прототипов рестриктаз. Таким образом, у исследователей имеется потенциальная возможность расщеплять ДНК и продукты ПЦР по 238 различающимся по структуре специфичным участкам. В конкретных экспериментах весь это набор ферментов конечно не используется. Вместе с тем успешное решение таких задач, как физическое картирование, выделение фрагментов нуклеиновых кислот, определение нуклеотидной последовательности, разрыв ДНК в желаемом месте во многом зависит от возможностей, представленных существующими вариантами субстратной специфичности рестриктаз. Учитывая структурное разнообразие ДНК, очевидно, что имеющийся набор эндонуклеаз рестрикции еще далек от удовлетворения всех нужд научных исследований. Поэтому поиск новых эндонуклеаз, обладающих способностью специфически расщеплять ДНК в доселе недоступных для этого участках, как и других новых и интересных ферментов метаболизма ДНК и РНК, не теряет актуальности и с успехом осуществляется на практике в лабораториях НПО "СибЭнзим".