Биотехнология, 2002, № 1, С 15-20
Фермент с молекулярной массой 33 кД был выделен и очищен более чем в 200 раз. Определены оптимальные условия действия фермента: pH 9,5, 25 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl. Фермент наиболее активен при 37°C. Показано, что выделенный фермент является эндонуклеазой, которая гидролизует нативную и денатурированную нагреванием ДНК и РНК до олигонуклеотидов длиной 3-5 нуклеотидных остатка с 5 -фосфатом на конце.
Эндонуклеазы - это класс ферментов, специфически гидролизующих нуклеиновые кислоты с образованием достаточно коротких олигонуклеотидов. При этом продукты гидролиза могут варьировать по длине, а также по расположению фосфомоноэфирной группы на 3'-или 5'-конце. Кроме того, активность эндонуклеаз в отношении различных субстратов (нативная и денатурированная ДНК или РНК) может сильно различаться. Встречаются эндонуклеазы, действие которых зависит от окружения фосфодиэфирной связи [1].
Цель данного исследования - очистка и изучение свойств эндонуклеазы, обнаруженной нами в штамме Proteus vulgaris 84, фермента, перспективного для использования в биохимических исследованиях, а также в медицинской практике в качестве противовирусного препарата.
Биомассу бактериального штамма P. vulgaris 84 (ВКПМ, В-3671) выращивали при 37°C в бульоне с 1 % триптона (AGS GmbH, Германия), 0,5 % дрожжевого экстракта (той же фирмы),
0,5 % NaCl, pH 7,4. В ферментер, содержащий 20 л бульона, инокулировали 1 л ночной культуры и выращивали 7 ч при частоте вращения мешалки 200 об/мин и аэрацией воздухом с интенсивностью 10 л/мин. Оптическая плотность при этом достигала 2 ед. при 550 нм. Клетки осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин. В результате получали 80-90 г биомассы, которую хранили при -20°C.
Полученную биомассу (10 г) ресуспендировали в буфере (10 мМ трис-НС1, pH 7,6, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанол) и разрушали клетки с помощью ультразвукового дезинтегратора. Клеточные обломки удаляли центрифугированием при 15 000 об/мин в течение 30 мин. Грубый экстракт фракционировали гель-фильтрацией на колонке (100x2,6 см) биогеля А 0,5 т, элюируя буфером: 0,8 М NaCl, 10мМ трис-НС1, pH 7,6, 5 % глицерина, 0,1 % тритона Х-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанол. Скорость элюции составляла 40 мл/ч. Фракции с эндонуклеазной активностью объединяли и диализовали против буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1, pH 7,6, 1 мМ 2-меркаптоэтанол. Ионообменную хроматографию проводили на ДЭАЭ-целлюлозе (колонка 10x2 см). На колонку наносили обессоленный раствор фермента и элюировали линейным градиентом концентрации
NaCl (0-0,5 М) в буфере: 10 мМ трис-НС1, pH 7,6,1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанол. Объем градиента составлял 400 мл. Дальнейшую очистку фермента проводили хроматографией на гепарин-сефарозе. Перед нанесением на колонку фермент диализовали против 10 объемов буфера (10 мМ трис-НС1, pH 7,6, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанол), наносили на колонку (10x1 см) гепарин-сефарозы и элюировали 200 мл градиента 0-0,4 М NaCl в буфере: 10 мМ трис-НС1, pH 7,6, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ 2-меркаптоэтанол. Фракции, содержащие ферментативную активность, концентрировали против буфера: 10 мМ трис-НС1, pH 7,6, 100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ 2- меркаптоэтанол, 50% глицерина.
Активность определяли по гидролизу ДНК [2]. За 1 ед. активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 30 мин при 37°C.
Проводили с помощью гель-фильтрации на колонке (100x0,9 см) ультрагеля АсА 44. Для калибровки колонки применяли белки с известной молекулярной массой (бычий сывороточный альбумин (БСА), овальбумин, химотрипсиноген, лизоцим).
При подборе оптимальных условий действия эндонуклеазы активность фермента определяли по степени гидролиза ДНК после 2 ч инкубации при 37°C [2].
Для установления рН-оптимума использовали следующие буферные системы: К-фос-фатный буфер, pH 7,0-7,6; трис-HCl буфер, pH 7,6-8,6; глицин-NаОН-буфер, pH 8,6-10,0, в конечной концентрации 10 мМ.
При определении оптимума температуры реакцию проводили при 24°C, 37°C и 42°C.
Для обнаружения влияния ионов металлов и ЭДТА на активность эндонуклеазы концентрацию MgCl2 варьировали от 5 до 50 мМ, NaCl - от 0 до 200 мМ, КС1 использовали в концентрации 100 мМ, ЭДТА - от 1 до 10 мМ.
Действие фермента на различные субстраты определяли путем гидролиза нативной ДНК, денатурированной ДНК, высокополимерной РНК из дрожжей, суммарной РНК.
Проводили на ДЭАЭ-целлюлозе восходящим градиентом 0-0,3 М NaCl в 7 М мочевине при pH 7,0 по методу [3]. Поглощение элюата регистрировали с помощью Uvicord S II при 260 нм с записью на самописце.
Для определения места разрыва межнуклеотидной связи эндонуклеазой гидролизат ДНК инкубировали в течение 1 ч в присутствии экзонуклеазы I E. coli, имеющей высокую чувствительность к свободным 3'- ОН- группам [4].
Концентрацию белка определяли по методу [5].
Выделение эндонуклеазы I из грубого экстракта проводили гель-фильтрацией через колонку биогеля А 0,5 т. Фракции с эндонуклеазной активностью объединяли и диализовали. Дальнейшую очистку фермента проводили ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Фракции с эндонуклеазной активностью объединяли, обессоливали диализом и наносили на колонку гепарин-сефарозы. Фермент с колонки элюировали градиентом NaCl в буфере и концентрировали против буфера, содержащего 50% глицерина. Фермент хранился при -20°C в течение года без потери активности. Результаты очистки фермента представлены в таблице 1.
Объект | Суммарный белок, мг | Активность общая, ед. • 10-3 | Удельная активность, ед. /мг • 10-3 | Выход по активности, % | Степень очистки |
Грубый экстракт |
948
|
432
|
0,46
|
100
|
1
|
Элюат с биогеля А 0,5 m |
704
|
340
|
0,48
|
79
|
1,04
|
Элюат с ДЭАЭ-целлюлозы |
56
|
180
|
3,2
|
42
|
7
|
Элюат с гепарин-сефарозы |
0,68
|
66,5
|
98
|
15,4
|
212
|
Таблица 1. Выделение эндонуклеазы I из 10 г биомассы P. vulgaris 84
Рис. 1. Определение молекулярной массы эндонуклеазы с помощью гель-фильтрации. Точки соответствуют молекулярной массе маркеров: БСА, овальбумина, химотрипсиногена, лизоцима. Стрелкой обозначена молекулярная масса исследуемой эндонуклеазы
Молекулярная масса эндонуклеазы I из P. vulgaris 84, определенная гель-фильтрацией на калиброванной колонке с ультрагелем АсА 44, составила 31-35 кД (рис. 1).
При определении зависимости активности эндонуклеазы I от pH оценивалась активность фермента в различных буферных системах в диапазоне pH от 7,0 до 10,0. С увеличением pH буфера активность фермента возрастала и достигала максимума в глицин-NaOH- буфере, pH 9,5. Дальнейшее увеличение значений pH раствора приводило к снижению активности эндонуклеазы I (рис. 2).
Рис. 2. Зависимость активности эндонуклеазы от pH использованных буферов:
D- К-фосфатный буфер;
х- трис-НС1-буфер;
• - глицин-NaOH-буфер
Фермент наиболее активен при 37°C. При 24°C и 42°C скорость ферментативного гидролиза ДНК значительно снижалась и составляла соответственно 12 и 30 % от активности при 37°C. Прогревание ферментного препарата в течение 2 мин при 95°C приводило к полной инактивации эндонуклеазы I (данные не приведены).
Поскольку для проявления эндонуклеазной активности необходимо присутствие ионов Mg2+, была исследована зависимость активности фермента от концентрации Mg2+ . Как видно из результатов, представленных на рис. 3, зависимость активности фермента представляет собой колоколообразную кривую с достаточно широким максимумом (от 15 до 35 мМ)
Рис. 3. Зависимость активности эндонуклеазы от концентрации MgCl2
Влияние ионной силы на ферментативную активность оказывается выраженным довольно слабо (рис. 4). Так, изменение концентрации NaCl в реакционной смеси от 0 до 200 мМ приводило к 1,5-кратному изменению активности эндонуклеазы I. Максимум ферментативной активности наблюдался в присутствии примерно 100 мМ NaCl и 25 мМ MgCl2, незначительно сдвигаясь вправо в присутствии 10 мМ MgCl2. Замена ионов Na+ на ионы K+ не оказывала влияния на активность фермента (результаты не приведены). Присутствие ЭДТА в концентрации от 1 до 5 мМ не влияло на активность фермента, что указывает на то, что эндонуклеаза I, видимо, не является металлоферментом.
Рис. 4. Зависимость активности эндонуклеазы от концентрации NaCl: 1 — в присутствии 10 мМ MgCl2; 2 — в присутствии 25 мМ MgCl2
Изучение действия эндонуклеазы I на различные субстраты показало, что максимальную активность фермент проявляет в отношении нативной ДНК. Скорость гидролиза денатурированной ДНК составляла 84 % от скорости гидролиза нативной ДНК. Скорость гидролиза РНК была еще ниже и составляла 32 % для высокополимерной дрожжевой РНК и 21 % для суммарной РНК (данные не приведены).
Хроматографическое разделение продуктов исчерпывающего гидролиза ДНК проводили ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе в присутствии 7 М мочевины, которая снимает вторичные взаимодействия олигонуклеотидов с сорбентом, и разделение происходит исключительно в соответствии с количеством отрицательно заряженных фосфатных групп [3]. Из результатов, представленных на рис.5, а, видно, что основными продуктами расщепления ДНК являются три-, тетра- и пентануклеотиды, а образования мононуклеотидов практически не наблюдается. Эти результаты свидетельствуют об эндонуклеазном характере действия фермента. При разделении конечных продуктов гидролиза электрофорезом в ПААГ также обнаружено, что гидролитическое расщепление идет с образованием тетра- и пентануклеотидов (результаты не приведены).
Рис. 5. Разделение ионообменной хроматографией в присутствии 7 М мочевины: а - продуктов исчерпывающего гидролиза ДНК эндонуклеазой I P. vulgaris; б - продуктов исчерпывающего гидролиза ДНК эндонуклеазой I P. vulgaris, дополнительно обработанных экзонуклеазой I E.coli
Для определения места разрыва межнуклеотидной связи продукты полного гидролиза ДНК эндонуклеазой I P. vulgaris инкубировали в присутствии экзонуклеазы I E.coli, имеющей высокую чувствительность к свободным З'-ОН-группам [4]. Полученные продукты реакции разделяли ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе в присутствии 7 М мочевины. На хроматографическом профиле видно (см. рис. 5, б), что продукты реакции соответствуют моно- и динуклеотидам. Как известно [4], экзонуклеаза I гидролизует цепь ДНК, начиная с 3'-гидроксильного конца, последовательно отщепляя нуклеозид-5'-монофосфаты, пока не останется динуклеотид. Полученные результаты говорят о том, что продуктами гидролиза ДНК эндонуклеазой I из P. vulgaris 84 являются олигонуклеотиды с 5'-фосфатной группой на конце.
Таким образом, полученные данные позволяют судить, что эндонуклеаза I, полученная из биомассы Proteus vulgaris штамм 84, является ферментом с молекулярной массой порядка 33 кД. Фермент гидролизует нативную и денатурированную нагреванием ДНК и РНК до олигонуклеотидов длиной 3-5 нуклеотидных остатка с 5'-фосфатом на конце. Эндонуклеаза I P. vulgaris проявляет оптимальную активность при pH 9,5 в присутствии 25 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl. Фермент наиболее активен при 37° и инактивируется прогреванием.
Выделенная нами эндонуклеаза I Р. Vulgaris по основным биохимическим свойствам сходна с хорошо изученной внеклеточной эндонуклеазой из Serratia marcescens [6], хотя и не инактивируется, в отличие от последней, в присутствии ЭДТА. Кроме того, следует отметить, что штамм S. Marcescens является условно-патогенным [7], а это вызывает определенные сложности при работе с этим продуцентом, тогда как штамм P. vulgaris 84 таковым не является и может более широко использоваться в микробиологическом производстве.