Сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза FaiI узнает вырожденную четырёхнуклеотидную последовательность 5'-YA^TR-3'

Категория: Новые ферменты

Просмотров: 11162

Изучена субстратная специфичность новой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы FaiI, которая узнает и расщепляет последовательность 5’-YA↑TR-3’, а также гидролизует с меньшей активностью сайт 5’-YA↑TY. При замене в последовательности узнавания одного из центральных AT нуклеотидов, фермент проявляет никазную активность, причем расщепляется та цепь сайта узнавания, в которой сохраняется тимин. FaiI расщепляет ДНК, содержащую в сайте узнавания 5-метилцитозин, N4-метилцитозин и N6-метиладенин. Ключевые слова: сайт-специфическая эндонуклеаза, вырожденная последовательность узнавания, мелкощепящая эндонуклеаза.

Наиболее изученной группой сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз являются эндонуклеазы рестрикции II типа, которые узнают последовательность ДНК длиной 4-8 п.н. и требуют в качестве кофактора только ионы Mg²⁺ [1]. Некоторые из узнаваемых последовательностей рестриктаз представляют собой вырожденные сайты, т.е., соответствующий фермент узнает сразу несколько последовательностей. Например, сайтом узнавания рестриктазы AcsI является последовательность RAATTY, которая включает в себя сайты AAATTT, GAATTT, AAATTC и GAATTC [2]. Как правило, все такие сайты расщепляются ферментом с одинаковой эффективностью и полностью, а картина гидролиза ДНК соответствует последовательному расщеплению субстратной ДНК по всем отдельным сайтам. Часть эндонуклеаз рестрикции при неоптимальных условиях реакции способны расщеплять неканонические последовательности узнавания, проявляя неспецифическую активность, так называемую star activity [3]. Это явление характерно для хорошо известных рестриктаз EcoRI [4], BamHI [5] и ряда других ферментов [6].
В данной работе представлена новая сайт-специфическая эндонуклеаза FaiI из Flavobacterium aquatile B15, которая расщепляет вырожденную четырёхнуклеотидную последовательность 5'-YA↑TR-3', однако при тех же условиях реакции расщепляет и другие последовательности ДНК с меньшей активностью. То есть, фермент FaiI, по сравнению с обычными рестриктазами, имеет более высокий уровень неспецифической активности, которая к тому же проявляется в рекомендуемых условиях реакции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали следующие реактивы: акриламид, бис-акриламид («Хеликон», Россия), агароза («Hybaid-AGS», Германия), ЭДТА («Fluka AG», Швейцария), Tris («Promega», США), буферные растворы, ферменты, препараты ДНК, маркер молекулярных масс ДНК и олигонуклеотиды производства ООО «СибЭнзим».

Гидролиз ДНК эндонуклеазой FaiI

Плазмидную ДНК в количестве 1 мкг расщепляли в объёме 20 мкл в SE-буфере B (10 mM Tris HCl pH 7.9 (при 25°C), 10 mM MgCl₂, 1mM DTT) при 50°C. Продукты гидролиза плазмидной ДНК разделяли электрофорезом в 15% ПАА геле в трис-ацетатном буфере. После окрашивания в растворе бромистого этидия, фотографировали в УФ свете.

Гидролиз олигонуклеотидов эндонуклеазой FaiI

В качестве субстратов для эндонуклеазы FaiI в экспериментах использованы олигонуклеотидные дуплексы следующего состава:

1  5’-CGAGTTCATGGCTGGGCCCAAC-3’
2  3’-GCTCAAGTACCGACCCGGGTTG-5’
3  5’-CGAGTTCATAGCTGGGCCCAAC-3’
4  3’-GCTCAAGTATCGACCCGGGTTG-5’
5  5’-CGAGATTATAGCTGGGCCCAAC-3’
6  3’-GCTCTAATATCGACCCGGGTTG-5’
7  5’-CGAGTTTATTACTGGGCCCAAC-3’
8  3’-GCTCAAATAATGACCCGGGTTG-5’
9  5’-CGAGTTGATGGCGCGGCCCAAC-3’
10 3’-GCTCAACTACCGCGCCGGGTTC-5’
11 5’-CGAGTTAATCGCGCGGCCCAAC-5’
12 3’-GCTCAATTAGCGCGCCGGGTTG-5’
13 5’-CGAGTTCGTGGCTGGGCCCAAC-3’
14 3’-GCTCAAGCACCGACCCGGGTTG-5’
15 5’-CGAGTTCTTGGCTGGGCCCAAC-3’
16 3’-GCTCAAGAACCGACCCGGGTTG-5’
17 5’-CGAGTTCAAGGCTGGGCCCAAC-3’
18 3’-GCTCAAGTTCCGACCCGGGTTG-5’
19 5’-CGAGTTCACGGCTGGGCCCAAC-3’
20 3’-GCTCAAGTGCCGACCCGGGTTG-5’’
21 5’-CGAGTTCGCGGCTGGGCCCAAC-3’
22 3’-GCTCAAGCGCCGACCCGGGTTG-5’
23 5’-CGAGTTCATGGCTGGGCCCAAC-3’
24 3’-GCTCAAGTACCGACCCGGGTTG-5’
25 5’-CTGAGTACATGTCCAAGGCCTTGGACTTAA-3’
26 3’-GACTCATGTACAGGTTCCGGAACCTGAATT-5’
27 5’-CTGAGTAC(N6A)TGTCCAAGGCCTTGGACTTAA-3’
28 3’-GACTCATGT(N6A)CAGGTTCCGGAACCTGAATT-5’
29 5’-CTGAGTA(5mC)ATGTCCAAGGCCTTGGACTTAA-3’
30 3’-GACTCATGTA(5mC)AGGTTCCGGAACCTGAATT-5’
31 5’-CTGAGTA(N4C)ATGTCCAAGGCCTTGGACTTAA-3’
32 3’-GACTCATGTA(N4C)AGGTTCCGGAACCTGAATT-5’

Предполагаемый сайт узнавания FaiI в каждом дуплексе выделен жирным шрифтом. Сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции FaeI (5’-CATG↑-3’) подчеркнут.
Одну из цепей олигонуклеотидного дуплекса метили по 5’-концу с помощью Т4 полинуклеотидкиназы и γ-[³²P]ATP. Меченный олигонуклеотид очищали гель-фильтрацией на колонках MicroSpin G-25 (Amersham Biosciences UK Ltd., Англия) согласно протоколу производителя. Олигонуклеотидный дуплекс образовывали путем смешивания меченного олигонуклеотида с комплементарным немеченным олигонуклеотидом до концентрации 180 nM каждого в SE-буфере B. Реакционную смесь прогревали 5 минут при 95°C, а затем остужали до комнатной температуры. Гидролиз проводили 2-мя единицами фермента в 10 μl реакционной смеси в течение 25 минут при 50°C. Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в денатурирующем 20% ПААГ с 7М мочевиной в Трис-боратном буфере. Радиоавтограф геля получали с помощью Personal Molecular Imager (BioRad, USA).
За одну единицу активности принимали количество фермента необходимое для гидролиза 1 pmol олигонуклеотидного дуплекса 1/2 за 1 час при 50°С в 20 μl реакционной смеси, содержащей оптимальный SE-буфер B.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой FaiI

На рисунке 1 показана картина расщепления ДНК плазмиды pUC19 различными количествами эндонуклеазы FaiI. Как видно из рисунка, глубина гидролиза плазмиды зависит от количества используемого фермента. Поскольку четкую картину исчерпывающего сайт-специфического гидролиза плазмидной ДНК получить не удалось, было предположено, что FaiI расщепляет нуклеотидные последовательности с разной эффективностью.

Рис. 1. Сайт-специфический гидролиз ДНК плазмиды pUC19 различными количествами эндонуклеазы FaiI в течение 1 часа. Цифрами обозначено использованное количество единиц фермента. Справа приведена теоретическая картина расщепления по сайту 5’-YATR-3’.
M - маркёр молекулярных весов ДНК – pUC19/MspI

Определение субстратной специфичности эндонуклеазы FaiI

Для выявления последовательностей узнаваемых ферментом FaiI были проведены эксперименты по гидролизу олигонуклеотидных дуплексов различного состава. В результате было установлено, что наиболее эффективно эндонуклеаза FaiI расщепляет сайт узнавания 5’-YATR-3’. На рисунке 2 представлены результаты расщепления олигонуклеотидных дуплексов, содержащих варианты указанного сайта, а также некоторые сайты с заменами 1-го и 4-го нуклеотидов, ферментом FaiI.

Рис. 2. Исходные (k) и гидролизованные эндонуклеазой FaiI (FaiI) олигонуклеотидные дуплексы с заменами 1го и 4го нуклеотидов в сайте узнавания. * обозначены 5’-³²P меченые олигонуклеотиды в дуплексе. Внизу приведены последовательности ДНК в сайте узнавания фермента.

В соответствии с данными рисунка 2 FaiI проявляет максимальную активность на субстратах содержащих сайт узнавания 5’-YATR-3’ (5’-CATG-3’ - дуплекс 1/2, 5’-CATA-3’ - дуплекс 3/4, 5’-TATG-3’ – дуплекс 4/3, 5’-TATA-3’ – дуплекс 5/6), где наблюдается полное расщепление ДНК. В случае замены пурина или пиримидина (5’-TATT-3’ дуплекс 7/8, 5’-AATA-3’ дуплекс 8/7, 5’-GATG-3’ – дуплекс 9/10, 5’-CATC-3’ – дуплекс 10/9) наблюдается частичный гидролиз ДНК. Подобная слабая активность, приблизительно в 8-10 раз ниже активности на оптимальном субстрате, наблюдается на всех сайтах вида 5’- YATY -3’ (данные не приводятся). В случае одновременной замены обоих крайних нуклеотидов, т.е. и пурина и пиримидина расщепления вообще не происходит (5’-AATC-3’ - дуплекс 11/12, 5’-GATT-3’ - дуплекс 12/11).
На рисунке 3 приведены результаты гидролиза эндонуклеазой FaiI олигонуклеотидных дуплексов, содержащих сайт узнавания с заменами в центральной паре нуклеотидов.

Рис. 3. Исходные (k) и гидролизованные эндонуклеазой FaiI (FaiI) олигонуклеотидные дуплексы с заменами 2-го и 3-го нуклеотидов в сайте узнавания. * обозначены 5’-³²P меченые олигонуклеотиды в дуплексе. Внизу приведены последовательности ДНК в сайте узнавания фермента.

Как видно из рисунка 3 при замене одного нуклеотида в центральной AT паре фермент проявляет никазную активность, причем расщепляется та цепь сайта узнавания, в которой сохраняется тимин (дуплексы 13/14 – 5’-CTTG-3’ и 15/16 – 5’-CGTG-3’). Для исключения возможности влияния соседних нуклеотидов на никазную активность, были проверены дуплексы того же состава, с зеркальным расположением цепей сайта узнавания (дуплексы 20/19 – 5’-CTTG-3’ и 18/17 – 5’-CGTG-3’). Замена обоих центральных нуклеотидов приводит полному отсутствию активности фермента (5’-CGCG-3’ - дуплекс 21/22).

Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой FaiI

На рисунке 4 представлены результаты гидролиза олигонуклеотидного дуплекса 1/2 эндонуклеазой FaiI и рестриктазой FaeI (сайт узнавания 5'-CATG↑-3'). Продукты частичного расщепления того же дуплекса экзонуклеазой III использованы в качестве маркера молекулярных длин.

Рис. 4. Определение места гидролиза FaiI на дуплексе 1/2 в сравнении с FaeI, (a) – 5’-³²P меченный олигонуклеотид 1 и (b) – 5’-³²P меченный олигонуклеотид 2.
1 – дуплекс 1/2;  2 - дуплекс 1/2 + FaiI; 
3 - дуплекс 1/2 + ExoIII;  4 - дуплекс 1/2 + FaeI

Как видно из рисунка, длина фрагмента ДНК, образующегося при расщеплении олигонуклеотидного дуплекса ферментом FaiI, на два нуклеотида короче, чем длина продукта гидролиза FaeI. Следовательно, эндонуклеаза FaiI расщепляет последовательность ДНК 5'-CATG-3' сразу после аденина, образуя тупые концы.

В настоящее время описано лишь небольшое количество сайт специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих короткие (3-4 нуклеотида) вырожденные последовательности ДНК. К таким ферментам относится эндонуклеаза рестрикции CviJI и ее изошизомеры из Chlorella virus, узнающие и расщепляющие нуклеотидную последовательность 5'-RGCY-3' [7]. CviJI правомерно относить к эндонуклеазам рестрикции, поскольку она входит в состав соответствующей системы рестрикции-модификации. При этом метилаза РМ-системы CviJI модифицирует клеточную ДНК, делая ее устойчивой к расщеплению рестриктазой CviJI.
На рисунке 5 приведены данные по расщеплению последовательности 5'-CATG-3', содержащей различные метилированные основания, ферментом FaiI. Как видно из рисунка 5, FaiI расщепляет последовательность узнавания с метилированными основаниями N6A, N4C и 5mC. Таким образом, наличие указанных метилированных оснований в сайте узнавания фермента не блокирует его активность и остается не ясным, почему ДНК Flavobacterium aquatile B15 не расщепляется ферментом FaiI in vivo. Можно предположить, что FaiI является секретируемым ферментом, в связи с чем, клетки Flavobacterium aquatile B15 не нуждаются в соответствующей ДНК-метилтрансферазе. Возможно также, что ДНК Flavobacterium aquatile B15, в отличие от других бактериальных ДНК, дополнительно модифицирована, например, гликозилирована, и это модификация блокирует гидролиз ДНК ферментом FaiI. Дальнейшие исследования позволят определить причину устойчивости ДНК Flavobacterium aquatile B15 к расщеплению ферментом FaiI.

Рис. 5. Исходные (k) и гидролизованные эндонуклеазой FaiI (FaiI) олигонуклеотидные дуплексы с метилированными основаниями в сайте узнавания. * обозначены 5’-³²P меченые олигонуклеотиды в дуплексе. Внизу приведены сайты узнавания фермента.

По сравнению с рестриктазами, которые, как правило, узнают и гидролизуют в ДНК последовательности из 4-х и более нуклеотидов, эндонуклеаза FaiI расщепляет ДНК значительно глубже и, соответственно, может быть использована для более мелкой фрагментации ДНК и получения соответствующих геномных библиотек (quasi-random shotgun library) [7]. Кроме того, продукты расщепления ДНК в виде олигодезоксирибонуклеотидов могут применяться при мечении ДНК и картировании фрагментов рестрикционного анализа [7].

ЛИТЕРАТУРА

1. Pingoud A., Jeltch A. 2001. Structure and function of type two restriction endonucleases. Nucleic Acid Research. 29, 3705-3727.
2. Degtyarev S. Kh., Kolyhalov A.A., Rechkunova N.I., Abdurashitov M.A. 1992. Acs I, a new restriction endonuclease from Arthrobacter citreus 310 recognizing 5'-Pu^AATTPy-3'. Nucleic Acids Research. 20, 3789.
3. Янулайтис А.А. 1989. Ферменты рестрикции и их применение. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Биотехнология. т.17, с.201.
4. Polisky B., Greene P., Garfin D.E., McCarthy B.J., Goodman H.M., Boyer H.W. 1975. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72, 3310-3314.
5. George J., Blakesley R.W., Chirikjian J.G. 1980. Sequence-specific endonuclease BamHI. J. Biol. Chem. 255, 6521-6524.
6. Malyguine E., Vannier P., Yot P. 1980. Alteration of the specificity of restriction endonucleases in the presence of organic solvents. Gene. 8, 163-177.
7. Swaminathan N., Mead D.A., McMaster K., George D., Van Etten J.L., Skowron P.M. 1996. Molecular cloning of the three base restriction endonuclease R.CviJI from eukaryotic Chlorella virus IL-3A. Nucleic Acids Res. 24, 2463-2469.