Новая сайт-специфическая эндонуклеаза AbsI из Arthrobacter species 7М06 узнает октануклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-CC^TCGAGG-3’

 

В.А. Чернухин, Ю.Г. Каширина, Ю.Э. Томилова, Д.А. Гончар, В.С. Дедков, Н.А. Михненкова, С.Х. Дегтярев

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2006, т. 2, №2, с. 29-34

 

Обнаружен бактериальный штамм Arthrobacter species 7М06, который является продуцентом новой сайт-специфической эндонуклеазы AbsI. Фермент AbsI узнает палиндромную октануклеотидную последовательность ДНК 5’-CC↑TCGAGG-3’ и гидролизует ее после второго цитозина, образуя, таким образом, 5’-выступающие «липкие» концы, которые совместимы с концами, образующимися при гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции XhoI (5’-C^TCGAG-3’), PspXI (5’-VC↑TCGAGB-3’) и SalI (5’-G↑TCGAC-3’). Среди всех известных редкощепящих эндонуклеаз рестрикции AbsI является единственным ферментом, не имеющим сайтов узнавания на стандартных субстратов, таких как ДНК фагов лямбда и Т7, а также аденовирусной ДНК типа 2.

 

Эндонуклеазы рестркиции (рестриктазы, ЭР) являются сайт-специфическими бактериальными ДНК-эндонуклеазами и входят, как правило, в состав так называемых систем рестрикции-модификации (РМ систем). Наиболее широкое практическое применение в молекулярной биологии и биотехнологии нашли ЭР второго типа, которые узнают короткую последовательность ДНК и расщепляют ее внутри или вблизи сайта узнавания. В настоящее время описано более 250 различных сайтов узнавания ЭР второго типа, из которых только 9 представляют собой невырожденные палиндромные восьминуклеотидные последовательности [1].
В данной работе описано получение и изучение свойств новой сайт-специфической эндонуклеазы AbsI, сайтом узнавания которой является восьминуклеотидная последовательность ДНК 5’-CC↑TCGAGG-3’.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Морфологические и биофизические свойства штамма бактерии Arthrobacter species 7М06 определяли стандартным образом [2]. GC-состав хромосомной ДНК этого микроорганизма определяли как описано ранее [3].

 

Выращивание клеток штамма Arthrobacter species 7М06

В качестве компонентов питательной среды для выращивания бактериальных клеток использовалась продукция фирмы «Organotechnie» (Франция). Культивирование проводили при 28°С в колбах ёмкостью 700 мл с 300 мл среды LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, (pH 7,6)) в термостатированных воздушных качалках G-25 («New Brunswick», США) со встряхиванием (170 об/мин). Клетки выращивались в течение двух суток до достижения оптической плотности 2,5 ед. при измерении на длине волны λ=550 нм. Клетки осаждали центрифугированием в течение 30 минут при 3000 g на центрифуге «Beckman J2-21» («Beckman», США) и замораживали.

 

Очистка препарата фермента AbsI

Все стадии очистки фермента проводили при 4°С или на льду. Замороженную биомассу (30 г) суспендировали в течение 3-х часов в 120 мл буфера А, содержащего 10 мМ K-фосфат (pH 7,2), 0,2 М KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол. Клетки разрушали ультразвуком на дезинтеграторе Soniprep 150 («MSE», Великобритания) десятью 1 минутными импульсами с 1 минутными интервалами. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 12000 g в течение 30 мин на центрифуге «Beckman J2-21». Из полученного супернатанта выделяли фермент AbsI путем хроматографической очистки на трех сорбентах. На первой стадии использовали 40 мл фосфоцеллюлозы P11 («Whatman», Великобритания). Элюцию фермента проводили 400 мл линейного градиента KCl (0,2-0,9 М) в буфере А. На второй стадии использовали 5 мл гидроксиапатита («BioRad», США). Фермент вымывали 120 мл линейного градиента K-фосфата (0,01-0,2 М) в буфере А. На третьей стадии использовали 4 мл гепарин-сефарозы («Sigma», США). Элюцию фермента проводили 60 мл линейного градиента KCl (0,3-1 М) в буфере А.
Для тестировании активности ЭР AbsI в хроматографическом профиле аликвоты по 1 мкл из фракций добавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0,8 мкг ДНК pBlueScriptSK(+), предварительно линеаризованной рестриктазой ZrmI, в SE-буфер 5 «G» (10 мМ Трис-HCl (pH 7.6), 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ), смесь инкубировали 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл стоп-раствора, содержащего 0,1М ЭДТА, 0,05% бромфенолового синего и 40% агарозы. Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере.
После очистки на гепарин-сефарозе к фракциям, содержащим фермент добавили БСА до концентрации 0,05 мг/мл и сконцентрировали диализом против буфера, содержащего 10 мМ K-фосфат (pH 7,2), 0,2 М KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол и 50% глицерин.
В результате получили 2,5 мл препарата фермента. Препарат AbsI хранили при -20°С.

 

Определение специфичности эндонуклеазы рестрикции AbsI

В качестве субстратов для определения сайта узнавания AbsI использовали ДНК фагов лямбда и Т7, аденовирусную ДНК типа 2 (Ad2), плазмиду pBlueScriptSK(+) (pBS) [4] и специально сконструированную плазмиду pUC19SE, получение которой описано ниже. Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в трис-ацетатном буфере.
Для определения позиции гидролиза узнаваемой последовательности рестриктазой AbsI использовали олигонуклеотидный ДНК-дуплекс, одну из цепей которого метили с помощью γ-[32P]-АТФ и Т4-полинуклеотидкиназы. Исходные олигонуклеотиды были синтезированы в НПО «СибЭнзим» (Россия). Продукты ферментативного гидролиза разделяли электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Радиоавтографию геля проводили с помощью прибора Cyclone Storage System («Packard Instrument Co.», USA).
Все использованные ферменты и маркеры молекулярного веса ДНК произведены в НПО «СибЭнзим».
Первичную последовательность ДНК определяли методом Сенгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).



РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Штамм Arthrobacter species 7М06 был выделен из природных изолятов в ходе поиска продуцентов рестриктаз, как описано ранее [5]. Определение штамма дало следующие результаты. Клетки штамма сферические, диаметром 0,5 мкм, в парах или одиночные. Грамположительные. Облигатно аэробные. Колонии на агаре Луриа бледно-жёлтые, гладкие, блестящие, непрозрачные, выпуклые, круглые, 1-2 мм в диаметре. В бульоне со встряхиванием образуют гомогенную муть. Каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С. GC-состав хромосомной ДНК составляет 75%. Данный штамм определили как Arthrobacter species 7М06, а сайт-специфическую эндонуклеазу, выделенную из него, назвали AbsI.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper23_fig1.jpg

 

Рис. 1. Электрофорез препаратов ДНК фага лямбда (a), фага Т7 (b), Ad2 (c) и плазмиды pBS/ZrmI (d), обработанных рестриктазами Sfr274I, PspXI и AbsI. Дорожки: 1 – исходная ДНК; 2 – гидролиз Sfr274I; 3 - гидролиз PspXI; 4 – гидролиз AbsI; 5 – гидролиз Sfr274I и AbsI; M – 1kb ДНК-маркер;

 



На рисунке 1 приведены данные по расщеплению сайт-специфической эндонуклеазой AbsI различных субстратов. Как видно из рисунка, AbsI не гидролизует ДНК фагов лямбда и Т7, а также Ad2 ДНК, однако способен расщеплять плазмиду pBlueScriptSK(+), линеаризованную ферментом ZrmI (сайт узнавания 5’-AGT^ACT-3’). При совместном гидролизе pBlueScriptSK(+) рестриктазами Sfr274I (сайт узнавания 5’-С↑TCGAG-3’) и AbsI новые рестрикционные фрагменты не образуются. В связи с этим мы предположили, что AbsI имеет расширенный сайт узнавания фермента Sfr274I. В ДНК плазмиды pBlueScriptSK(+), сайт узнавания Sfr274I (5’-CTCGAG-3’) является частью палиндромной последовательности 5’-CCTCGAGG-3’ и эта последовательность нуклеотидов в дальнейшем рассматривалась как возможный сайт узнавания фермента AbsI. Для проверки этого предположения нами были синтезированы комплементарные олигонуклеотиды K61 и К62, образующие ДНК-дуплекс (палиндромная восьминуклеотидная последовательность выделена жирным шрифтом):

 

K61: 5’-gtatcctcgaggtcctgatcaaggt-3’
K62: 5’-accttgatcaggacctcgaggatac-3’



Последовательность ДНК 5’-CCTCGAGG-3’является общей частью данного дуплекса и плазмиды pBlueScriptSK(+). На рисунке 2b приведен радиоавтограф электрофоретического разделения продуктов гидролиза олигонуклеотидного дуплекса K62*/K61 рестриктазами AbsI, Sfr274I, а также экзонуклеазой III из E.coli. Как видно из этого рисунка, AbsI расщепляет олигонуклеотидный дуплекс K62*/K61, а длина фрагмента ДНК, полученного в результате расщепления дуплекса, совпадает с длиной фрагмента ДНК, образованного в результате расщепления рестриктазой Sfr274I. Таким образом, фермент AbsI узнает последовательность ДНК 5’-CCTCGAGG-3’, а место гидролиза олигонуклеотида ферментами AbsI и Sfr274I совпадает, то есть оба фермента расщепляют ДНК в последовательности 5’-CC↑TCGAGG-3’ после второго цитозина.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper23_fig2.jpg

 

 

Рис. 2. Определение позиции расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции AbsI с использованием γ-32P-меченных олигонуклеотидных дуплексов K62*/K61(a) и Xho3*/Xho4(b). Дорожки: 1 – исходный дуплекс; 2 - гидролиз рестриктазой AbsI; 3 - гидролиз рестриктазой Sfr274I; M - гидролиз экзонуклеазой III из E.coli;

 

 



Для определения возможности вырождения установленного сайта узнавания фермента AbsI мы проанализировали наличие в различных субстратах последовательностей ДНК, отличающихся от последовательности 5’-CCTCGAGG-3’ на один нуклеотид. В таблице 1 приведены данные по существованию таких нуклеотидных последовательностей в ДНК фагов лямбда и Т7 и в Ad2 ДНК. С учетом симметричности последовательности 5’-CCTCGAGG-3’ всего таких замен возможно 12, из которых 11 содержатся в упомянутых субстратах (таблица 1). Так как AbsI не гидролизует ДНК фагов лямбда и Т7 и Ad2 ДНК, следовательно присутствующие в них 11 последовательностей ДНК не являются сайтами узнавания AbsI.

 

5'- A CTCGAGG -3' *

Фаг лямбда (33497)

5'- G CTCGAGG - 3'

Ad2 (5777, 8243)

5'- T CTCGAGG - 3'

-

5'- C A TCGAGG - 3'

Фаг T7 ( 23430, 31496), Ad2 (24884)

5'- C G TCGAGG - 3'

Фаг лямбда (17654), фаг T7 ( 23202), Ad2 (23849, 24203)

5'- C T TCGAGG - 3'

Фаг T7 ( 6057, 8975, 18705)

5'- CC A CGAGG - 3'

Ad2 (930)

5'- CC G CGAGG - 3'

Фаг лямбда (10, 3159), Ad2 (11342, 13090, 19053)

5'- CC C CGAGG - 3'

Ad2 (16880)

5'- CCT A GAGG - 3'

Фаг Т7 (10310)

5'- CCT G GAGG - 3'

Ad2 (12167, 13183, 14981, 25421)

5'- CCT T GAGG - 3'

Фаг Т7 (82, 13863, 14655, 14982, 19021, 32888, 39006, 39858), Ad2 (9199)


Таблица 1. Однонуклеотидные замены в сайте 5’-CCTCGAGG-3’ и их наличие в ДНК фагов лямбда и Т7 и Ad2 ДНК (жирным шрифтом обозначены нуклеотиды, которые отличаются при сравнении с последовательностью ДНК 5’-CCTCGAGG-3’)



Последовательность ДНК 5’-TCTCGAGG-3’является единственной, отсутствующей в субстратных ДНК, использованных в данной работе (таблица 1). Для проверки способности фермента AbsI гидролизовать эту последовательность, мы синтезировали следующие олигонуклеотиды, образующие ДНК-дуплекс:

 

Xho3: 5’-gca ata atc tcg agg cct aga gga ata agc-3’
Xho4: 5’-gct tat tcc tct agg cct cga gat tat tgc-3’



В указанной первичной структуре последовательность 5’-TCTCGAGG-3’ и комплементарная ей 5’-CCTCGAGA-3’ выделены жирным шрифтом.
На рис. 2b приведена радиоавтография геля после электрофоретического разделения продуктов обработки этого дуплекса ферментами. Как видно из рисунка фермент AbsI не гидролизует дуплекс Xho3*/Xho4 (32P-меченная цепь обозначена символом *).
Таким образом, AbsI не расщепляет последовательностей ДНК, полученных изменением одного из нуклеотидов в сайте 5’-CCTCGAGG-3’. Полученные данные подтверждают, что именно невырожденная последовательность нуклеотидов 5’-CCTCGAGG-3’ является сайтом узнавания фермента AbsI.
Для проверки сайта узнавания фермента AbsI и получения еще одного субстрата для этой эндонуклеазы мы изменили первичную структуру широко используемой плазмиды pUC19, заменив последовательность 5’-GC-3’ в положении 437-438 на последовательность 5’-CG-3’. Для этого были синтезированы комплементарные олигонуклеотиды Xho1 и Xho2, формирующие ДНК-дуплекс с выступающими липкими концами, совместимыми с липкими концами, образуемыми при расщеплении рестриктазами XbaI (5’-T↑CTAGA-3’) и HindIII (5’-A↑AGCTT-3’):


Xho1: 5’-ctagagtcgactgtttaaacctcgaggcatgca-3’
Xho2: 5’-agcttgcatgcctcgaggtttaaacagtcgact-3’


Олигонуклеотидный дуплекс сшивался с pUC19, гидролизованой ферментами XbaI и HindIII, и продуктом лигазной сшивки трансформировали компетентные клетки E.coli RR1. Среди полученных в результате трансформации клонов выбрали один, из которого была выделена плазмида pUC19SE. Плазмида pUC19SE содержит последовательность 5’-CCTCGAGG-3’ в положении 434-441, что было подтверждено определением нуклеотидной последовательности данной плазмиды. На рисунке 3 приведены результаты расщепления плазмиды pUC19SE, линеаризованной ферментом DriI (сайт узнавания 5’-GACNNN^NNGTC-3’). Как видно из рисунка, AbsI расщепляет линеаризованную плазмиду pUC19SE, тогда как исходная плазмида pUC19 этим ферментом не гидролизуется (данные не приводятся).

b_320_200_16777215_00_Pics_paper23_fig3.jpg

 

 

 

Рис. 3 Расщепление ферментом AbsI ДНК плазмиды pUC19SE, линеаризованной DriI. Дорожки: 1 – 1kb ДНК-маркер; 2 - pUC19SE/DriI; 3 - pUC19SE/DriI, обработанная эндонуклеазой AbsI

 

 



Для определения активности фермента AbsI мы также использовали плазмиду pUC19SE. AbsI проявляет максимальную активность в специальном реакционном буфере следующего состава: 20 mM ТрисHCl (при pH 8,0), 20 mM MgCl2, 0.01% Тритон X-100, 1 мМ ДТТ. За одну единицу активности данной сайт-специфической эндонуклеазы мы принимали такое минимальное количество фермента, при котором происходит полный гидролиз 1 мкг ДНК плазмиды pUC19SE, предварительно линеаризованной рестриктазой DriI, в 50 мкл реакционной смеси, содержащей AbsI-реакционный буфер при 37°С. Полученный нами препарат фермента имел концентрацию 1000 ед/мл.
Среди всех известных редкощепящих эндонуклеаз рестрикции AbsI является единственной эндонуклеазой, не имеющей сайтов узнавания ни на одном из стандартных субстратов (ДНК фагов лямбда и Т7, а также ДНК аденовируса типа 2), используемых при поиске новых ферментов рестрикции.
Поскольку XhoI и AbsI содержат в сайте узнавания одну и ту же палиндромную шестинуклеотидную последовательность 5’-CTCGAG-3’ и расщепляют ее в одном и том же месте, можно предположить, что эволюционно эндонуклеаза AbsI произошла из ЭР, узнающей сайт 5’-CTCGAG-3’. Помимо AbsI, XhoI и его изошизомеров известно еще несколько ферментов с другой специфичностью, имеющих сайты узнавания с внутренней последовательностью 5’-C^TCGAG-3’. Среди них можно отметить недавно открытую рестриктазу PspXI, узнающую вырожденную восьминуклеотидную последовательность 5’-VC^TCGAGB-3’, которая может рассматриваться как промежуточное звено между ферментами, имеющими шестинуклеотидные и невырожденные восьминуклеотидные сайты узнавания [6]. Кроме того, известен изошизомер XhoI, который гидролизует сайт 5’-C^TCGAG-3’ при условии, что перед ним с 5’-конца нет динуклеотида СТ, т.е. этот фермент не расщепляет последовательность 5’-СТC^TCGAG [7].
AbsI является новым и перспективным инструментом для генно-инженерных работ, который может быть использован при крупноблочной фрагментации ДНК. Помимо этого, поскольку при расщеплении по сайту узнавания AbsI образуются такие же липкие концы, как при гидролизе рестриктазами XhoI (5’-C↑TCGAG-3’), PspXI (5’-VC↑TCGAGB-3’) и SalI (5’-G↑TCGAC-3’), новая сайт-специфическая эндонуклеаза AbsI может применяться совместно с этими ферментами при клонировании фрагментов ДНК.



ЛИТЕРАТУРА

  1. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J., Macelis D.REBASE restriction enzymes and methyltransferases // Nucleic Acids Research. – 2003. – Vol.31. – P.418-420.
  2. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта и др.: 9-е издание в 2-х томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. – М., 1997.
  3. Дедков В.С. Определение GC-cостава в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции // Биотехнология. – 2004. - № 4. – С.77 – 82.
  4. Short J.M., Fernandez J.M., Sorje J.A., Huse W.D. Lambda ZAP: a bacteriophage lambda expression vector with in vivo excision properties // Nucleic Acids Research. – 1988. – Vol.16. – P.7583-7600.
  5. Белавин П.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. - 1988. – Т.24. – №1 – С.50-51. (интернет-версия)
  6. Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Беличенко О.А., Дедков В.С., Мезенцева Н.В., Томилова Ю.Э., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции PspXI узнает необычную последовательность ДНК 5’-VCTCGAGB-3’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2005. – Т.1 – №1. – С.18-23. (интернет-версия)
  7. Gingeras T.R. and Brooks J.E. Cloned restriction /modification systev from Pseudomonas aeruginosa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1983. – Vol.80. – P.402-406.



ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

РМ система – система рестрикции-модификации, ЭР – эндонуклеаза рестрикции, Трис – трис-(оксиметил)-аминометан, ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота, ДТТ – дитиотрейтол, п.н. – пары нуклеотидов, Ad2 – аденовирус типа 2, pBS – плазмида pBlueScriptSK(+), БСА – бычий сывороточный альбумин.