function keepAlive() { var myAjax = new Request({method: "get", url: "index.php"}).send();} window.addEvent("domready", function(){ keepAlive.periodical(3600000); });
Главная  //  Научные статьи  //  Новые ферменты  //  Новая метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI узнаёт и расщепляет последовательность ДНК 5'-G^C(5mC)GGC-3'

Новая метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI узнаёт и расщепляет последовательность ДНК 5'-G^C(5mC)GGC-3'

 

В.А. Чернухин, Е.В. Килёва, Ю.Э. Томилова, А.А. Болтенгаген, В.С. Дедков, Н.А. Михненкова, Д.А. Гончар, Л.Н. Голикова, С.Х. Дегтярёв

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 1 – С. 14 - 20

 

Выделена новая 5-метилцитозин-зависимая сайт-специфическая ДНК эндонуклеаза KroI из Kocuria rosea 307, узнающая и расщепляющая последовательность ДНК 5'-G↑CCGGC-3'/3'-CGGCC↑G-5' при наличии в центральном динуклеотиде и его комплементе 5'-CG-3'/3'-GC-5' одного или двух 5-метилцитозинов. КroI не гидролизует неметилированную ДНК, а также метилированные последовательности 5'-G(5mC)CGGC-3'/3'-CGGC(5mC)G-5' и 5'-G(5mC)CGG(5mC)-3'/3'-(5mC)GGC(5mC)G-5'. KroI является первой сайт-специфической метилзависимой эндонуклеазой, узнающей невырожденную шестинуклеотидную последовательность. Благодаря своей способности расщеплять только метилированную ДНК фермент KroI может найти практическое применение в молекулярно-биологических работах, в частности, для определения статуса метилирования ДНК эукариот.

 

Наиболее изученными сайт-специфическими эндонуклеазами являются эндонуклеазы рестрикции типа II (рестриктазы), которые, как правило, являются частью бактериальной системы рестрикции-модификации, содержащей еще ДНК-метилтрансферазу. Рестриктаза расщепляет чужую ДНК по определенному сайту, а ДНК-метилтрансфераза метилирует эту же последовательность в бактериальной ДНК, предотвращая, таким образом, ее гидролиз собственной эндонуклеазой рестрикции.
К рестриктазам близки по свойствам метилзависимые сайт-специфические эндонуклеазы, которые гидролизуют только метилированную ДНК. Первыми были обнаружены и описаны ферменты, узнающие и расщепляющие последовательность ДНК 5’-G(m6A)TC-3’ [1]. Эндонуклеазы, расщепляющие 5-метилцитозин-содержащие последовательности ДНК, описаны сравнительно недавно [2], [3], [4] и [5]. Эти ферменты узнают определенные последовательности ДНК, содержащие 5-метилцитозин, не требуют кофакторов помимо ионов Mg2+, гидролизуют субстрат полностью и в тех же условиях, что и эндонуклеазы рестрикции [6]. Вследствие этого, данные ферменты были названы метилзависимыми сайт-специфическими ДНК эндонуклеазами. К таким ферментам относится эндонуклеаза GlaI, которая узнает и расщепляет нуклеотидную последовательность 5’-Pu(5mC)↑GPy-3'/3’-PyG↓(5mC)Pu-5’ [2]. Описаны также сайт-специфические эндонуклеазы BlsI [3], BisI [4] и GluI [5], сайтами узнавания которых является C5-метилированная нуклеотидная последовательность 5’-GCNGC-3'.
В данной работе представлена новая метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI, узнающая и расщепляющая последовательность ДНК 5'-G↑CCGGC-3'/3'-CGGCC↓G-5' при наличии в центральном динуклеотиде и его комплементе 5'-CG-3'/3'-GC-5' одного или двух 5-метилцитозинов.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

Реактивы

В работе использовали следующие реактивы и компоненты питательных сред: Tris («Promega», США); акриламид, бис-акриламид, KH2PO4, NaHCO3, ампициллин («Helicon», Россия); ЭДТА («Fluka AG» Швейцария), агароза («Hybaid-AGS», Германия), тритон Х-100 («ICN», США), лизоцим («Serva», Германия), фенилметилсульфонилфторид (PMSF) («Sigma», США), фосфоцеллюлоза P-11 («Whatman», Англия), гепарин-сефароза («BioRad», США), триптон, дрожжевой экстракт («Organotechnie», Франция), ферменты и препараты ДНК (НПО «СибЭнзим»). Остальные реагенты – отечественного производства квалификации х.ч.

 

Выращивание штамма-продуцента

Выращивание штамма проводили в ферментёре 1601-013 (LKB, Швеция) при температуре 30°С в 10 л питательной среды, содержащей 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl и 0,05% MgCl2, при рН 7,5 с аэрацией 10 л/мин и перемешиванием 200 об/мин. При достижении культурой поздней логарифмической стадии роста клетки осаждали с помощью центрифугирования при 5000 об/мин при 4°С. В результате получили 100 г биомассы, которую хранили при -20°С.

 

Выделение фермента

Все процедуры выделения фермента проводили при температуре 4°С. 20 г замороженной биомассы суспендировали в 80 мл буфера А (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол), содержащего 0,05 М NaCl, 0,3 мг/мл лизоцим, 0,1 мМ PMSF, и инкубировали в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Далее клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали в течение 30 мин в роторе JA-20 на центрифуге "Beckman" J2-21 при 15000 об/мин.
Супернатант наносили на колонку с фосфоцеллюлозой P-11 объёмом 40 мл, предварительно уравновешенную буфером А, содержащим 0,05 М NaCl. Белок элюировали линейным градиентом NaCl (0,05 М – 1,0 М) в буфере А объёмом 400 мл, собирая фракции по 10 мл. Фракции, содержащие эндонуклеазу, объединяли и наносили на колонку с гидроксиапатитом объёмом 4 мл, предварительно уравновешенную буфером B (0,01 М K2HPO4, pH 7,2, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол). Колонку промывали 10 мл буфера B и проводили элюцию линейным градиентом K2HPO4 (0,01 – 0,2 М), собирая фракции объёмом по 4 мл. Активные фракции объединяли и наносили на колонку с гепаринсефарозой объёмом 4 мл. Элюцию проводили линейным градиентом NaCl (0,05 М – 0,5 М) в буфере А объёмом 120 мл, собирая фракции по 3 мл.
Активные фракции объединяли и диализовали против 20 объёмов концентрирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,05 М NaCl, 50% глицерин). Препарат хранили при -20°С.

 

Конструирование плазмид

Плазмида pMHpaII-1 была получена путем клонирования ПЦР-фрагмента геномной ДНК Haemophilus parainfluenzae, длиной 1156 п.о., содержащего ген ДНК-метилтрансферазы M.HpaII, в вектор pMTL22 по сайтам эндонуклеаз рестрикции PstI (перед стартовым кодоном) и XbaI (после стоп-кодона).
Для получения ПЦР-фрагмента использовали следующие праймеры:

M.HpaII_up (PstI): 5’-agagatacagactgcagtttatgaaagatgtg-3’
M.HpaII_low (XbaI): 5’-gccaataatctagagccggcgtaaggctcactccac-3’

Второй праймер содержит последовательность 5’-GCCGGC-3’ рядом с сайтом узнавания рестриктазы XbaI. В плазмиде pMHpaII-1 присутствуют три сайта 5’-GCCGGC-3’.
Плазмида pMMspI-1 была получена путем клонирования ПЦР-фрагмента геномной ДНК Moraxella species, длиной 1341 п.о., содержащего ген M.MspI, в вектор pMTL22 по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI (перед стартовым кодоном) и PstI (после стоп-кодона).
Для получения ПЦР-фрагмента использовали следующие праймеры:

M.MspI_up (BamHI): 5’-agatttggatcccaaatgaaacctgaaatattg-3’
M.MspI_low (PstI): 5’-gtcggactgcaggccggctaactgaatttcgtatatga-3’

Второй праймер содержит последовательность 5’-GCCGGC-3’ рядом с сайтом узнавания рестриктазы PstI. В плазмиде pMMspI-1 присутствуют два сайта 5’-GCCGGC-3’.



Гидролиз плазмидной и фаговой ДНК эндонуклеазой KroI и электрофорез продуктов гидролиза

Гидролиз ДНК проводили при 37°С в течение 2 часов в 20 мкл реакционной смеси содержащей буфер следующего состава: 10 мМ Трис -HCl (pH 8,5 при 25°C); 20 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол и ДНК в количестве 0,5 мкг. Для разделения продуктов гидролиза плазмидной ДНК применяли электрофорез в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ. В качестве маркёра молекулярных весов ДНК в электрофореграммах использовали 1 kb ДНК-маркёр (от 250 п.о. до 10000 п.о.) («СибЭнзим», Россия).



Определение позиции гидролиза ДНК на олигонуклеотидных дуплексах

Позиции гидролиза ДНК сайт-специфической эндонуклеазой KroI были установлены путем сравнения длин фрагментов, образующихся при расщеплении [32P]-меченных синтетических олигонуклеотидных дуплексов эндонуклеазами KroI и MroNI. В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой III из E.coli. Расщепление ДНК проводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис -HCl (pH 8,5 при 25°C); 20 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол, при 37°С в течение 1 часа. Фрагменты ДНК, образующиеся в результате расщепления олигонуклеотидных дуплексов, разделяли электрофорезом в денатурирующем 20% ПААГ с 7 М мочевиной.
В работе использовались олигонуклеотидные дуплексы, полученные гибридизацией из следующих синтетических олигонуклеотидов, синтезированных в НПО «СибЭнзим» (Россия):

 

17 5’-CCATAGGATGCCTCTATGGCCGGCCACGGACCGTATC-3
18 5’-GATACGGTCCGTGGCCGGCCATAGAGGCATCCTATGG-3’
19 5’-CCA55’-AGGATGCCTCTATGGC(5mC)GGCCACGGACCGTATC-3’
20 5’-GATACGGTCCGTGGC(5mC)GGCCATAGAGGCATCCTATGG-3’
21 5’-GCTAG TTGGA AGGCC GGCGA AGAAT GATG-3’
22 5’-CATC ATTCTTCGCC GGCCT TCCAA CTAGC-3’
23 5’-GCTAG TTGGA AGGC(5mC) GGCGA AGAAT GATG-3’
24 5’-CATC ATTCTTCGC(5mC) GGCCT TCCAA CTAGC-3’

 

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Микробиологическое описание штамма-продуцента

Бактериальный штамм-продуцент новой сайт-специфической ДНК зндонуклеазы был выделен из образца почвы. Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками. Клетки кокковидные, размером 1-2 мкм в диаметре. Спор не образуют. Грамположительные. Облигатно аэробные. Каталазоположительные. Растут при температуре от 10 до 40 °С, при pH от 6 до 9.
На основании анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [7], а также с помощью анализа первичной структуры фрагмента гена 16S РНК [8] штамм идентифицировали как вид бактерии Kocuria rosea (старое видовое название Micrococcus roseus). Новая сайт-специфическая эндонуклеаза была названа KroI согласно принятой номенклатуре [9].



Получение препарата фермента

Фермент выделяли из клеточного экстракта путём последовательных хроматографических процедур, как описано в разделе "Материалы и методы". Выход фермента составил 1,5 мл препарата с концентрацией 1000 ед/мл.



Определение субстратной специфичности KroI

В качестве субстратов для определения специфичности нового фермента использовали метилированные и неметилированные ДНК фагов λ (предварительно расщепленную рестриктазой AspA2I по единственному сайту узнавания, для облегчения визуализации на электрофорезе продуктов гидролиза эндонуклеазами MroNI и KroI) и Т7, а также ДНК плазмиды pBR322. Отдельно, с помощью метилазы M.SssI проводили метилирование всех 5'-CG-3'-динуклеотидов в ДНК фага λ и плазмиде pBR322, а затем гидролизовали такую метилированную ДНК ферментом KroI. В качестве контроля использовали гидролиз субстратов эндонуклеазой рестрикции MroNI (неошизомер NaeI), которая расщепляет немодифицированную последовательность 5'-G↑CCGGC-3'. При анализе специфичности проверяли также способность KroI расщеплять ДНК фага λ, в которой с помощью М.СviPI предварительно были метилированы цитозины во всех динуклеотидах 5'-GC-3'
На рис. 1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК фагов λ и Т7, а также плазмиды pBR322 эндонуклеазой KroI.

 

Электрофореграмма продуктов расщепления субстратных ДНК эндонуклеазами KroI и MroNI

Рис 1. Электрофореграмма продуктов расщепления субстратных ДНК эндонуклеазами KroI и MroNI.
Дорожки:
1 - ДНК фага λ, обработанная рестриктазой AspA2I (λ/AspA2I), 2 - ДНК λ/AspA2I + M.SssI
3 - ДНК λ/AspA2I + M.CviPI, 4 - ДНК λ/ AspA2I + MroNI
5 - ДНК λ/AspA2I + M.SssI + MroNI, 6 - ДНК λ/AspA2I + KroI
7 - ДНК λ/AspA2I + M.CviPI + KroI, 8 - ДНК λ/AspA2I + M.SssI + KroI
9 - ДНК pBR322, 10 - ДНК pBR322 + М.SssI
11 - ДНК pBR322 + KroI, 12 - ДНК pBR322 + MroNI
13 -ДНК pBR322 + М.SssI + KroI, M - 1 kb маркеры молекулярного веса ДНК


Как видно из рис. 1, KroI не расщепляет неметилированную ДНК фага λ (дорожка 6), ДНК фага λ, метилированную по последовательности 5'-GC-3' метилазой M.CviPI (дорожка 7); и неметилированную ДНК плазмиды pBR322 (дорожка 11). Однако, после обработки ДНК фага λ и плазмиды pBR322 метилазой SssI, метилирующей последовательность 5'-CG-3', эндонуклеаза KroI расщепляет такую метилированную ДНК (дорожки 8 и 13). Картина расщепления ДНК λ/AspA2I рестриктазой MroNI (дорожка 4) совпадает с картиной гидролиза эндонуклеазой KroI ДНК λ/AspA2I, метилированной ферментом SssI (дорожка 8). Аналогично, картина гидролиза плазмиды pBR322 рестриктазой MroNI (дорожка 12) совпадает с картиной гидролиза эндонуклеазой KroI ДНК pBR322, метилированной SssI (дорожка 13).
Эти два примера совпадения картин гидролиза метилированной и неметилированной ДНК эндонуклеазами KroI и MroNI, соответственно, подтверждают, что эти два фермента узнают одну и ту же последовательность ДНК 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5', однако, MroNI расщепляет эту последовательность только если она не метилирована, а KroI, наоборот, только если она метилирована, то есть, сайтом узнавания KroI является последовательность 5'-GC(5mC)GGC-3'/3'-CGG(5mC)CG-5'. При этом, не наблюдается гидролиза последовательности 5'-G(5mC)CGG(5mC)-3'/3'-(5mC)GGC(5mC)G-5', в которой центральные цитозины неметилированы (дорожка 7).
Для подтверждения сайта узнавания и определения активности фермента KroI мы сконструировали плазмиду pMHpaII-1 (см. «Материалы и методы»), которая содержит метилазу M.HpaII. Метилаза M.HpaII метилирует сайт 5’-CCGG-3’ с образованием 5’-C(5mC)GG-3’/3’-GG(5mC)C-5’, вследствие чего все три сайта 5’-GCCGGC-3’, имеющиеся в плазмиде pMHpaII-1 (один находится внутри гена метилазы M.HpaII, а еще два – в составе вектора), метилированы по центральным цитозинам.
Кроме того, мы сконструировали плазмиду pMMspI-1 (см. «Материалы и методы»), которая содержит метилазу M.MspI. Метилаза M.MspI также модифицирует сайт CCGG, однако метилированию подвергаются крайние цитозины c образованием последовательности 5’-(5mC)CGG-3’/3’-GGC(5mC)-5’, вследствие чего в плазмиде pMMspI-1 присутствуют два сайта 5’-G(5mC)CGGC-3’/3’-CGGC(5mC)G-5’.
Результаты обработки ДНК плазмид pMHpaII-1 и pMMspI-1, предварительно линеаризованных эндонуклеазой рестрикции DriI, приведены на рис. 2. Видно, что ДНК pMHpaII-1/DriI расщепляется эндонуклеазой KroI с образованием трёх фрагментов. Данная картина расщепления соответствует теоретически рассчитанной картине гидролиза ДНК этой плазмиды по сайту узнавания 5'-GCCGGC-3' (должны образовываться фрагменты длиной 1250, 1215, 1060 и 101 п.о.). Из рис. 2 также следует, что ДНК pMMspI-1/DriI, не расщепляется эндонуклеазой KroI (дорожка 2), хотя в этой плазмиде содержатся два сайта 5’-G(5mC)CGGC-3’/3’-CGGC(5mC)G-5’.

 

Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК плазмид pMHpaII-1 и pMMspI-1 эндонуклеазой KroI

 

Рис 2. Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК плазмид pMHpaII-1 и pMMspI-1 эндонуклеазой KroI.
Дорожки:
1 - ДНК pMMspI-1/DriI
2 – ДНК pMMspI-1/DriI + KroI
3 - ДНК pMHpaII-1/DriI
4 - ДНК pMHpaII-1/DriI + KroI
M - 1 kb маркеры молекулярного веса ДНК.

 


Таким образом, метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI не способна расщеплять метилированную последовательность ДНК 5'-G(5mC)CGGC-3'/3'-CGGC(5mC)G-5', однако расщепляет последовательность GC(5mC)GGC-3'/3'-CGG(5mC)CG-5'.
Из полученных результатов можно сделать вывод, что метилирование центральных остатков цитозина в последовательности 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5' является необходимым условием для проявления активности KroI.



Определение активности фермента

Для определения активности фермента KroI использовалась плазмида pMHpaII-1. За одну единицу активности сайт-специфической ДНК эндонуклеазы KroI мы принимали минимальное количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pMHpaII-1, предварительно линеаризованной рестриктазой DriI, в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис -HCl (pH 8,5 при 25°C); 20 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол, при 37°С. На рис.3 приведена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК плазмиды pMHpaII-1/DriI, обработанной 0,5, 1 и 2 мкл препарата KroI (дор. 2, 3 и 4, соответственно). Из данных на рисунке 3 следует, что активность фермента составляет 1ед./мкл.

Определение активности препарата KroI

 

 

Рис 3. Определение активности препарата KroI.
Дорожки:
1 – ДНК pMHpaII-1/DriI
2. – ДНК pMHpaII-1/DriI + 0,5 мкл препарата фермента KroI
3. – ДНК pMHpaII-1/DriI + 1 мкл препарата фермента KroI
4. – ДНК pMHpaII-1/DriI + 2 мкл препарата фермента KroI
M - 1 kb маркеры молекулярного веса ДНК.

 

 

Определение позиции гидролиза ДНК эндонуклеазой KroI

Для подтверждения правильности установленной последовательности узнавания KroI и определения позиции расщепления ДНК мы проводили гидролиз синтетических олигонуклеотидных дуплексов образованных из олигонуклеотидов 17, 18, 19, 20 (первичную структуру см. «Материалы и методы»).
Олигонуклеотиды 17 и 19 комплементарны олигонуклелеотидам 18 и 20. Дуплексы 17/18 и 19/20 имеют сходную последовательность и последняя пара отличается от первой только наличием 5-метилцитозинов в последовательности 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5'.
Определение места гидролиза ДНК KroI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазой рестрикции MroNI неметилированного олигонуклеотидного дуплекса, образованного из олигонуклеотидов 17 и 18, и гидролиза эндонуклеазой KroI метилированного дуплекса, образованного из олигонуклеотидов 19 и 20. В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ExoIII из E.coli.
На рис. 4 приведен радиоавтограф разделения продуктов расщепления радиоактивно меченных дуплекcов 17*/18 (знаком «*» указан меченый олигонуклеотид) и 19*/20 в 20% ПААГ, с 7М мочевиной. Как видно из рис. 4, фрагменты ДНК, образованные гидролизом MroNI и KroI соответствующих дуплексов имеют одинаковую длину, что говорит об идентичности позиций гидролиза узнаваемой последовательности у этих ферментов.

 

Определение позиции расщепления ДНК эндонуклеазой KroI

 

 

Рис 4. Определение позиции расщепления ДНК эндонуклеазой KroI.
Дорожки:
1 – дуплекс 17*/18
2 – дуплекс 19*/20
3 – дуплекс 17*/18, обработанный рестриктазой MroNI
4 – дуплекс 19*/20, обработанный KroI
5 – дуплекс 19*/20, обработанный экзонуклеазой ExoIII



На основе полученных результатов можно сделать вывод, что эндонуклеаза KroI расщепляет последовательность 5'-GC(5mC)GGC-3' перед первым остатком цитозина с образованием четырёхнуклеотидных 5'-выступающих концов аналогично рестриктазе MroNI.



Расщепление олигонуклеотидов ферментами MroNI и KroI

Мы также проверили способность ферментов MroNI и KroI расщеплять различные олигонуклеотиды и олигонуклеотидные дуплексы, содержащие метилированные цитозины. В качестве субстратов мы использовали олигонуклеотиды 21, 22, 23, 24, а также олигонуклеотидные дуплексы, образованные ими (см. структуру в «Материалах и методах»).
На рис. 5 изображен радиоавтограф разделения электрофорезом в 20% ПААГ с 7М мочевиной продуктов расщепления радиоактивно меченных неметилированных, полуметилированных и полностью метилированных олигонуклеотидных дуплексов, а также отдельных олигонуклеотидов.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper56_fig5s.jpg



 

Рис. 5. Гидролиз ферментами MroNI и KroI олигонуклеотидов.

Наверху над дорожками приведены номера используемых олигонуклеотидных дуплексов. Символом «И» обозначен исходный меченый олигонуклеотид или олигонуклеотидный дуплекс; символом «*» - обозначен меченый олигонуклеотид.

 


Как видно из рисунка 5, ферменты MroNI и KroI не расщепляют одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие последовательность 5’-GCCGGC-3’ и 5’-GC(5mC)GGC-3’. При этом неметилированные дуплексы 21*/22 и 22*/21 расщепляются рестриктазой MroNI, но не расщепляются эндонуклеазой KroI.
Из данных, приведенных на рисунке 5, также видно, что KroI расщепляет не только дуплексы, в которых в сайте узнавания метилированы оба центральных цитозина (дуплексы 23*/24 24*/23), но и полуметилированный субстрат (то есть содержащий последовательность 5’-GC(5mC)GGC-3’/3’-CGGCCG-5’ с одной метильной группой). На полуметилированном субстрате KroI расщепляет как неметилированную цепь (дуплекс 22*/23, 21*/24), так и метилированную цепь (дуплекс 23*/22, 24*/21). В то же время рестриктаза MroNI не расщепляет олигонуклеотидные дуплексы с полуметилированным сайтом, что соответствует общим свойствам эндонуклеаз рестрикции.
Таким образом, эндонуклеаза KroI узнаёт и эффективно расщепляет обе цепи последовательности 5'-G^CCGGC-3'/3'-CGGCC^G-5' при наличии в ней 5-метилцитозина в третьем положении в одной или обеих цепях ДНК. Следовательно, новый фермент может использоваться для выявления сайтов 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5', метилированных ДНК-метилтрансферазой HpaII, причем та же последовательность, модифицированная M.MspI, будет устойчива к действию KroI.
KroI является первой описанной метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазой, узнающей невырожденную шестинуклеотидную последовательность. Примечательно, что узнаваемая последовательность (за исключением статуса метилирования) и место гидролиза ДНК ферментом KroI совпадают с сайтом узнавания фермента MroNI. Более того, оба эти ферменты были выделены из разных штаммов бактерий, но одного и того же вида Micrococcus roseus.
Ранее была описана подобная пара ферментов. Метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза DpnI имеет сайт узнавания 5’-G(m6A)TC-3’/3’-CT(m6A)G-5’, тогда как рестриктаза DpnII узнает неметилированную последовательность 5’-GATC-3’/3’-CTAG-5’. Однако, в отличие от пары MroNI-KroI, DpnI расщепляет ДНК с образованием тупых концов, тогда как DpnII образует 5’-выступающие четырехнуклеотидные липкие концы [10]. Таким образом, нами подтверждено существование пар бактерий, относящихся к одному и тому же виду и продуцирующих эндонуклеазы с одинаковой последовательностью узнавания, но разным статусом метилирования.
Эндонуклеаза KroI может быть полезна для выявления и анализа метилированных участков ДНК. В частности, пара KroI/MroNI(NaeI) может применяться в эпигенетических работах аналогично паре ферментов HpaII и MspI, уже давно используемых в таких экспериментах [11].

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Lacks S. and Greenberg B.J. A deoxyribonuclease of Diplococcus pneumoniae specific for methylated DNA // Biol. Chem. – 1975. – Vol. 250. – P.4060-4066.
  2. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнаёт метилированную последовательность 5’-GCGC-3’. // Биотехнология. – 2006. – №4. – С.31–35. (интернет-версия)
  3. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнаёт последовательности ДНК 5’-G(5mC)NGC-3’ и расщепляет её с образованием 3’-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2007. – Т.3. – №1. – С.28-33. (интернет-версия)
  4. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis Т30 узнает метилированную последовательность ДНК 5’G(5mC)^NGC-3’ // Биотехнология. – 2005. – №3. – С.22-26. (интернет-версия)
  5. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая эндонклеаза GluI узнаёт метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN(5mC)G-5’ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2007. – Т.3. – №2. – С.13-17. (интернет-версия)
  6. Pingoud A., and Jeltch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. // Nucleic Acid Res. 2001. – Vol.29. – P.3705-3727
  7. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж. Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах): Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. – М., 1997.
  8. Madden T.L., Tatusov R.L. and Zhang J. Applications of network BLAST server. // Meth. Enzymol. – 1996. – Vol. 266. – P.131-141.
  9. Smith, H.O., Nathans, D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol.81. - P.419-423.
  10. Campa A.G., Springhorn S.S., Kale P., Lacks S.A. Proteins encoded by the DpnI restriction gene cassette. Hyperproduction and characterization of the DpnI endonuclease. // J. Biol. Chem. – 1988 – Vol. 63. – P. 14696-14702.
  11. Bird A.P., Southern E.M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. // J. Mol. Biol. – 1978. – Vol. 118 – P. 27-47.

 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5mC– 5-метилцитозин;
М. – ДНК-метилтрансфераза;
п.о. – пар оснований в ДНК;
ед. – единица активности;
PMSF – фенилметилсульфонилфторид;
ExoIII – экзонуклеаза III из E.coli;
ПААГ – полиакриламидный гель.