Новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК- эндонуклеаза MteI расщепляет последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5’

• 
• 

Категория: Новые ферменты

Просмотров: 7036

 

 

Новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза MteI выделена из штамма бактерии Microbacterium testaceum 17B. Фермент узнает С5-метилированную последовательность ДНК и не гидролизует неметилированную ДНК. MteI является первой из метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, узнающих протяженный сайт, при этом активность фермента зависит от числа 5-метилцитозинов и их положения в узнаваемой последовательности. MteI расщепляет сайт 5’-G(5mC)G(5mC)↑NG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GN↓(5mC)G(5mC)G-5’ как указано стрелками и эта последовательность является минимальным сайтом узнавания. Активность фермента существенно возрастает при замене в минимальном сайте узнавания 5’-GC-3’ динуклеотидов на 5’-G(5mC)-3’ динуклеотиды и появлении дополнительных 5’-G(5mC)-3’ динуклеотидов на 5'-концах нонануклеотида в обеих цепях ДНК. Благодаря своей способности расщеплять только протяженные метилированные последовательности ДНК фермент MteI может найти практическое применение в молекулярно-биологических и эпигенетических работах.

 

ВВЕДЕНИЕ

Метилзависимыми сайт-специфическими ДНК-эндонуклеазами (МД - эндонуклеазами) называют ферменты, которые узнают и расщепляют определенные метилированные последовательности ДНК и не гидролизуют немодифицированную ДНК. По своим свойствам эти ферменты похожи на хорошо изученные эндонуклеазы рестрикции и также как рестриктазы, они не требуют кофакторов помимо ионов Mg²⁺ .
В настоящее время известно несколько МД-эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих ДНК по последовательностям, содержащим 5-метилцитозин. В частности, к ним относится ДНК-эндонуклеаза GlaI, которая гидролизует метилированную последовательность ДНК 5'-R(5mC)GY-3', где R – пурин, Y - пиримидин [1].
Различные МД-эндонуклеазы могут узнавать сходные последовательности ДНК, отличающиеся только узором метилирования. Так ферменты BlsI, BisI, PkrI и Glul узнают и расщепляют С5-метилированную нуклеотидную последовательность 5'-GCNGC-3', однако первые два из них способны расщеплять эту последовательность при наличии в ней хотя бы двух 5-метилцитозинов, тогда как в случае PkrI и GluI для эффективного гидролиза требуется 3 и 4 метилированных основания, соответственно [2] , [3], [4] , [5].
В данной работе описана новая МД-эндонуклеаза MteI, узнающая и расщепляющая девятинуклеотидную метилированную последовательность ДНК.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

Препараты ферментов и субстраты для них

Для экспериментов использовали препараты ДНК фагов λ, T7 и различных С5-метилированных плазмид, которые были сконструированы ранее [2], [4], [6] или в данной работе, как описано ниже. Кроме того, использовали эндонуклеазы рестрикции, T4 ДНК-лигазу T4 полинуклеотидкиназу, ДНК-метилтрансферазы HspAI и Fsp4HI и буферные растворы для них производства НПО «СибЭнзим» (Россия).
В качестве маркёра молекулярных весов ДНК при получении электрофореграмм в агарозных гелях использовали ДНК-маркёр 1 kb («СибЭнзим», Россия).

 

Выращивание штамма-продуцента

Для получения биомассы клетки штамма-продуцента подращивали в чашке Петри на агаризованной среде LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, pH 7,5, 0,5% агар-агар) в течение ночи при 30°С. Свежевыращенные колонии переносили стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду LB и культивировали на качалках при 30°С при перемешивании - 150 об/мин до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С на центрифуге "Beckman" (США) в роторе JA-10.

 

Выделение фермента. Условия проведения выделения и используемые буферы

Выделение проводили при 4°С с использованием растворов:

буфер А - 10 мМ Трис-HCl pH 7,6; 0,1 мМ ЭДТА и 7 мМ 2-меркаптоэтанол;
буфер Б - 10 мМ К-фосфат pH 7,2; 0,1 мМ ЭДТА и 7 мМ 2-меркаптоэтанол.

 

Экстрагирование

20 г биомассы суспендировали в 60 мл буфера А с добавлением 0,2 М NaCl, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,1 мг/мл лизоцимома. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе Soniprep 150 («MSE», Англия) с диаметром адаптера 2 см. Обработку проводили при амплитуде 20 мкм 8 раз по 1 мин с интервалами на охлаждение в ледяной бане по 1 мин. Экстракт осветляли центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин в роторе JA-20 на центрифуге J2-21 («Bеckman», США).

 

Хроматография на фосфоцеллюлозе

Экстракт наносили на колонку объемом 30 мл, уравновешенную буфером А с 0,2 М NaCl, и промывали двумя колоночными объемами буфера А с 0,2 М NaCl . Cорбированный материал вымывали градиентом NaCl от 0,2 до 1 М объёмом 300 мл. В итоге получили 50 фракций, из которых отобрали и объединили фракции с 20-ой по 30-ую, содержащие целевую активность.

 

Хроматография на гидроксилапатите

Объединенные фракции наносили на колонку с гидроксилапатитом, объемом 4 мл, уравновешенную буфером Б, и промывали восемью мл буфера Б. Сорбированный материал вымывали линейным градиентом буфера Б от 0,01 М до 0,2 М К-фосфата объемом 150 мл. Было получено 50 фракций, из которых объединяли фракции с 10 по 18, содержащие целевую активность.

 

Хроматография на гепарин-сефарозе

Объединенные фракции наносили на колонку с 4 мл гепарин-сефарозы, уравновешенную буфером А с 0,1 М NaCl, и промывали восемью мл 0,1 М NaCl в буфере А. Сорбированный материал вымывали буфером А с линейным градиентом NaCl от 0,1 М до 0,6 М объемом 150 мл. Всего было получено 40 фракций, из которых объединяли фракции с 15 по 23, содержащие целевую активность.

 

Концентрирование и хранение препарата

Полученную объединенную фракцию, содержащую целевую активность, диализовали в течение 20 ч против 300 мл буфера А с 55% глицерином, 0,25 М NaCl и хранили при -20°С.

 

Конструирование плазмид, содержащих С5-метилированную ДНК

С целью определения субстратной специфичности и активности MteI мы сконструировали ряд плазмид, содержащих в своем составе гены ДНК-метилтрансфераз HspAI и Fsp4HI.

 

Конструирование C5-метилированных плазмид, содержащих ген ДНК-метилтрасферазы HspAI

Все новые плазмиды, содержащие метилазу HspAI, были созданы на основе плазмиды pHspAI (4118 п.н.), которая была ранее получена путем лигирования вектора pUC19/EcoRI и фрагмента геномной ДНК бактериального штамма Haemophilus species AI, включающего ген ДНК-метилтрансферазы HspAI [6]. Штамм Е.coli, несущий эту плазмиду, содержит активную метилазу HspAI, метилирующую первый цитозин в положении С5 на обеих цепях последовательности 5’-GCGC-3’ с образованием метилированной двуцепочечной последовательности 5’-G(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G-5’.
В ходе данной работы мы встраивали в ДНК плазмиды pHspAI путем лигирования различные олигонуклеотидные дуплексы по сайтам рестрикции PstI и Psp124BI.
В результате были получены четыре новые плазмиды, несущие дополнительные метилированные участки, образованные в результате модификации последовательностей встроенных олигонуклеотидных дуплексов метилазой HspAI.
1) pHspAI2 была получена путём встраивания фрагмента ДНК, образованного из следующих синтетических олигонуклеотидов:

Gl-1: 5'-c ggt agc gcg cgc tcc tct aga gtc gac ctg ca-3'
Gl-2: 5'-ggtc gac tct aga gga gcg cgc gct acc gag ct-3'

В результате встраивания данного дуплекса в плазмиде pHspAI2 появился новый метилированный сайт:

5’-CGGTAG(5mC) G(5mС)G(5mC) G CTCCTCTAGAGTCGACCTGCA-3’
3’-GCCATC G (5mC)G(5mС)G (5mC)GAGGAGATCTCAGCTGGACGT-5’

2) pHspAI4 была получена путём встраивания фрагмента ДНК, образованного из следующих синтетических олигонуклеотидов:

Gl-3: 5'-c ggt agc gcag cgc tcc tct aga gtc gac ctg ca-3'
Gl-4: 5'-ggtc gac tct aga gga gcg ctgc gct acc gag ct-3'

В результате встраивания данного дуплекса в плазмиде pHspAI4 появился новый метилированный сайт:

5’-CGGTAG(5mC) G СAG(5mC) G CTCCTCTAGAGTCGACCTGCA-3’
3’-GCCATC G (5mC)GTС G (5mC)GAGGAGATCTCAGCTGGACGT-5’

3) pHspAI10 была получена путём встраивания фрагмента ДНК, образованного из следующих синтетических олигонуклеотидов:

Gl-9: 5'-t ggt agcgc gcag cgcgc tcc tct aga gtc gac ctg ca-3'
Gl-10: 5'-ggtc gac tct aga gga gcgcg ctgc gcgct acc aag ct-3'

В результате встраивания данного дуплекса в плазмиде pHspAI10 появился новый метилированный сайт:

5’-TGGTAG(5mC)G(5mC)G СAG(5mC)G(5mC)G CTCCTCTAGAGTCGACCTGCA-3’
3’-ACCATC G(5mC)G(5mC)GTС G(5mC)G(5mC)GAGGAGATCTCAGCTGGACGT-5’

4) pHspAI12 была получена путём встраивания фрагмента ДНК, образованного из следующих синтетических олигонуклеотидов:

Gl-11: 5'-t ggt agcgc gcag cgc tcc tct aga gtc gac ctg ca-3'
Gl-12: 5'-ggtc gac tct aga gga gcg ctgc gcgct acc aag ct-3'

В результате встраивания данного дуплекса в плазмиде pHspAI12 появился новый метилированный сайт:

5’-TGGTAG(5mC)G(5mC)G CAG(5mC)G CTCCTCTAGAGTCGACCTGCA-3’
3’-ACCATC G(5mC)G(5mC)GTС G(5mC)GAGGAGATCTCAGCTGGACGT-5’

 

Конструирование C5-метилированных плазмид, содержащих ген ДНК-метилтрасферазы Fsp4HI

При конструировании новых субстратов мы также использовали плазмиды pFsp4HI2 и pFsp4HI3 [4], которые содержат ген метилтрансферазы Fsp4HI, метилирующей первый цитозин в последовательности 5’-GCNGC-3’ с образованием последовательности 5’-G(5mC)NGC-3’/3’-CGN(5mC)G-5’. Для получения новых субстратов мы встраивали в плазмиду pFsp4HI2 путем лигирования олигонуклеотидные дуплексы по сайтам рестрикции Bsp19I и HindIII. В результате были сконструированы три плазмиды, несущие дополнительные метилированные участки, образованные в результате метилирования встроенных олигонуклеотидных дуплексов метилазой Fsp4HI.
1) Плазмида pFsp4HI4 была получена путём встраивания фрагмента ДНК, образованного из синтетических олигонуклеотидов:

Fsp3: 5'-cat gtg ccg ccg ccgctcgaa ttc taga-3'
Fsp4: 5'-agct tct aga att cga gcg gcg gcg gca-3'

В результате встраивания данного дуплекса в pFsp4HI4 появился новый метилированный сайт:

5’-CATGTG(5mC)C G(5mC)C G(5mC)C G CTCGAATTCTAGA-3’
3’-GTACAC G G(5mC)G G(5mC)G G(5mC)GAGCTTAAGATCT-5’

2) pFsp4HI6 была получена путём встраивания фрагмента ДНК, образованного из синтетических олигонуклеотидов:

Fsp5: 5'-cat gtg ccg cag ccg ctcgaa ttc taga-3'
Fsp6: 5'-agct tct aga att cga gcg gct gcg gca-3'

В результате встраивания данного дуплекса в pFsp4HI6 появился новый метилированный сайт:

5’-CATGTG(5mC)C G(5mC)A G(5mC)C G CTCGAATTCTAGA-3’
3’-GTACAC G G(5mC)G T(5mC)G G(5mC)GAGCTTAAGATCT-5’

3) pFsp4HI8 была получена путём встраивания фрагмента ДНК, образованного из синтетических олигонуклеотидов:

Fsp7: 5'-cat gtg ctg cag cag ctcgaa ttc taga-3'
Fsp8: 5'-agct tct aga att cga gct gct gca gca-3'

В результате встраивания данного дуплекса в pFsp4HI8 появился новый метилированный сайт:

5’-CATGTG(5mC)T G(5mC)A G(5mC)A G CTCGAATTCTAGA-3’
3’-GTACAC G A(5mC)G T(5mC)G T(5mC)GAGCTTAAGATCT-5’

 

Сайт-специфический гидролиз ДНК эндонуклеазой MteI проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг ДНК в SE-буфере «Y» (33 мМ Трис-ацетат pH 7,9; 10 мМ Mg-ацетат; 66 мМ K-ацетат; 1 мМ дитиотреитол) при 48°С. Продукты реакции гидролиза разделяли путем электрофореза в буфере TAE в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7М мочевину, или в 1% агарозном геле.

 

Определение активности препарата фермента

За одну единицу активности MteI мы принимали такое минимальное количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза единственного сайта узнавания в 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI в 20 мкл реакционной смеси, содержащей SE-буфере «Y» при 48°С за 60 минут.

Для определения первичной структуры фрагмента гена 16S РНК проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с помощью следующих праймеров:

16S-direct 5'-AGAGTTTGATC(5mC)TGGCTCA-3'
16S-reverse 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'

Первичная структура полученного ПЦР-продукта определялась с помощью секвенатора Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Определение места гидролиза ДНК на олигонуклеотидном дуплексе. Позиция гидролиза ДНК ферментом MteI была установлена путем сравнения длин фрагментов, образующихся при расщеплении олигонуклеотидных дуплексов, содержащих предполагаемый сайт узнавания MteI.
Дуплексы были образованы из следующих синтетических олигонуклеотидов:

Mte3: 5’-CCGTACTTTG(5mC)G(5mC)AG(5mC)G(5mC)TTGATTCCC-3’
Mte4: 5’-GGGAATCAAG(5mC)G(5mC)TG(5mC)G(5mC)AAAGTACGG-3’
Glu7: 5’-CCGTACTTTG(5mC)G(5mC)GG(5mC)G(5mC)TTGATTCCC-3’
Glu8: 5’-GGGAATCAAG(5mC)G(5mC)CG(5mC)G(5mC)AAAGTACGG-3’.

Одну из цепей дуплекса метили по 5’-концу радиоактивным фосфором [³²P] и добавляли эквимолярное количество комплементарного олигонуклеотида, пробирку прогревали при 95°С в течение 5 мин и оставляли остывать на столе. Реакцию гидролиза проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей SE-буфер «G» (10 мМ Трис-HCl, pH 7,6; 10 мМ MgCl2; 50 мМ NaCl; 1 мМ дитиотреитол) и олигонуклеотидный дуплекс в концентрации 74 нМ при температуре 55°С в течение 1 часа. Электрофорез продуктов гидролиза проводили в денатурирующем 20%-ном ПААГ с 7 М мочевиной в трис-боратном буфере. Радиоавтографию геля проводили с помощью прибора Cyclone Storage System («Packard Instrument Co.» USA).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Микробиологическое описание штамма-продуцента MteI

Культурально-морфологические признаки. В ходе скрининга почвенных микроорганизмов нами был обнаружен бактериальный штамм-продуцент новой ДНК-эндонуклеазы. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (LB) штамм-продуцент образует гладкие блестящие, бледно-оранжевые колонии. Клетки палочковидные размером 0,8 х (1,5-2) мкм, неподвижные. Грамположительные.

Физиолого-биохимические признаки штамма-продуцента. Облигатный аэроб. Каталазоположительный. Оксидаза не обнаружена. Клетки растут при температуре от +10°С до +40°С, при pH от 6 до 9.
Полученная нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S РНК, на основании которой определили таксономическую специфичность изучаемого штамма:

   1 actggcggcg tgcttacaca tgcaagtcga acggtgaagc agagcttgct ctgtggatca
  61 gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgagcaa cctgccctgg actctgggat aagcgctgga
 121 aacggcgtct aatactggat atgagacgtg atcgcatggt caacgtttgg aaagattttt
 181 cggtctggga tgggctcgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct caccaaggcg
 241 tcgacgggta gccggcctga gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga
 301 ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcaac
 361 gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt ttagcaggga agaagcgaaa
 421 gtgacggtac ctgcagaaaa agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt
 481 agggcgcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg tttgtcgcgt
 541 ctgctgtgaa atcccgaggc tcaacctcgg gcctgcagtg ggtacgggca gactagagtg
 601 cggtagggga gattggaatt cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc aggaggaaca
 661 ccgatggcga aggcagatct ctgggccgta actgacgctg aggagcgaaa gggtggggag
 721 caaacaggct tagataccct ggtagtccac cccgtaaacg ttgggaacta gttgtgggga
 781 ccattccacg gtttccgtga cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg ggagtacggc
 841 cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac aagcggcgga gcatgcggat
 901 taattcgatg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tacaccagaa cgggccagaa
 961 atggtcaact ctttggacac tggtgaacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg
1021 tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttctatgttg ccagcacgta
1081 atggtgggaa ctcatgggat actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gatgacgtca
1141 aatcatcatg ccccttatgt cttgggcttc acgcatgcta caatggccgg tacaaagggc

По определителю [8], а также с помощью анализа первичной структуры фрагмента 16S РНК по программе BLAST [9] штамм-продуцент был определен как Microbacterium testaceum 17B. Продуцируемая этим штаммом сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза названа МteI согласно номенклатуре [10].

Получение препарата фермента

Выход биомассы составил 5 г/л. Из 20 г биомассы было получено 3,5 мл препарата фермента.

 

Гидролиз ДНК эндонуклеазой MteI

Предварительный анализ субстратной специфичности MteI на неметилированных и различных С5-метилированных субстратах.
В качестве субстратов для определения субстратной специфичности на первом этапе мы использовали ДНК фагов λ и Т7, ДНК плазмид pFsp4HI3 [4], pHspAI2 [6] и pHspAI10 (см. «Материалы и методы»). На рис. 1 приведены результаты обработки описанных выше субстратов эндонуклеазой MteI.

 

 

Рис. 1. Гидролиз препаратов ДНК ферментом MteI. Время реакции – 1 час. MteI добавляли по 1 мкл на 20 мкл реакционной смеси.

Дорожки:

1 – ДНК фага λ; 2 – ДНК фага λ+MteI;3 – ДНК фага Т7; 4 – ДНК фага Т7+MteI; 5 – pFsp4HI3/DriI; 6 – pFsp4HI3/DriI+MteI; 7 – pHspAI2/DriI; 8 – pHspAI2/DriI+MteI; 9 – pHspAI10/DriI; 10 – pHspAI10/DriI+MteI; 11 – маркёр молекулярного веса ДНК 1 kb.

 

Как видно из рисунка 1, MteI не расщепляет ДНК фагов λ (дорожка 2) и T7 (дорожка 4); ДНК плазмиды pFsp4HI3, которая метилирована по последовательности 5’-GCNGC-3’ и содержит метилированный сайт 5’-G(5mC)GG(5mC)-3’/3’-(5mC)GC(5mC)G-5’ (дорожка 6), а также не расщепляет ДНК плазмиды pHspAI2, содержащей сайт 5’-G(5mC)G(5mC)G(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G(5mC)G(5mC)G-5’ (дорожка 8). При этом, MteI расщепляет линеаризованную плазмиду pHspAI10 (дорожка 10), которая содержит последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)GCAG(5mC)G(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G(5mC)GTCG(5mC)G(5mC)G-5’.

 

Гидролиз субстратных ДНК, содержащих ген метилазы M.HspAI

Помимо плазмиды pHspAI10, являющейся субстратом MteI (рис.1 дорожка 10), мы проверили возможность гидролиза эндонуклеазой MteI плазмид pHspAI4 и pHspAI12, также содержащих ген метилазы HspAI (см. раздел «Материалы и методы»), но имеющих несколько другую структуру и узор метилирования сайта узнавания.
Как отмечалось в «Материалах и методах», все эти субстраты содержат последовательность 5’-GCGCAGCGC-3’ с разным окружением и отличающимся узором метилирования. В частности, в pHspAI4 эта последовательность представляет собой сайт 5’-G(5mC)GCAG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GTCG(5mC)G-5’, в pHspAI12 - 5’-G(5mC)G(5mC)GCAG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G(5mC)GTCG(5mC)G-5’, а в pHspAI10 - 5’-G(5mC)G(5mC)GCAG(5mC)G(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G(5mC)GTCG(5mC)G(5mC)G-5’.
Кроме того, для анализа субстратной специфичности MteI мы использовали эти же три плазмиды, дополнительно модифицированные метилазой Fsp4HI [11]. При их обработке метилазой Fsp4HI происходит метилирование цитозинов, прилегающих к центральному нуклеотиду A или T в обеих цепях в последовательности 5’-GCGCAGCGC-3’/3’-CGCGTCGCG-5’.

 

Рис. 2. Гидролиз плазмидных ДНК ферментами MteI и PkrI. Время реакции – 8 часов. Добавлено по 1 мкл препарата фермента на 20 мкл реакционной смеси.

Дорожки:

1 – pHspAI4/DriI;2 – pHspAI4/DriI+MteI;3 – pHspAI4/DriI+PkrI; 4 – pHspAI10/DriI; 5 – pHspAI10/DriI+MteI; 6 – pHspAI10/DriI+PkrI; 7 – pHspAI12/DriI; 8 – pHspAI12/DriI+MteI; 9 – pHspAI12/DriI+PkrI; 10 – маркёр молекулярного веса ДНК 1 kb; 11 – pHspAI4/DriI+M.Fsp4HI; 12 – pHspAI4/DriI+M.Fsp4HI+MteI; 13 – pHspAI4/DriI+M.Fsp4HI+ PkrI; 14 – pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI; 15 – pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI+MteI; 16 – pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI+PkrI; 17 – pHspAI12/DriI+M.Fsp4HI; 18 – pHspAI12/DriI+ M.Fsp4HI+MteI; 19 – pHspAI12/DriI+M.Fsp4HI+PkrI.

На рисунке 2 представлены результаты гидролиза ферментом MteI линейной формы плазмид pHspAI4, pHspAI10 и pHspAI12, а также продуктов их модификации метилазой M.Fsp4HI. В качестве фермента сравнения нами использовалась МД-эндонуклеаза PkrI, которая узнает и расщепляет последовательность 5’-GCNGC-3’ при наличии в обеих цепях сайта узнавания как минимум 3-х 5-метилцитозинов [5].
Как видно из рисунка 2, MteI не гидролизует pHspAI4 (дорожка 2), но расщепляет pHspAI10 и pHspAI12 (дорожки 5 и 8, соответственно), а также продукты метилирования этих плазмид ферментом M.Fsp4HI (дорожки 12, 15 и 18 соответственно). При этом только на 12-ой дорожке не наблюдается полного гидролиза исходной ДНК, что позволяет рассматривать последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)AG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GT(5mC)G(5mC)G-5 как минимальный сайт узнавания, тогда как сайт 5’-G(5mC)GCAG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GTCG(5mC)G-5’ (дорожка 2) не является субстратом фермента MteI.
Интересно отметить, что МД-эндонуклеаза PkrI не расщепляет модифицированную последовательность 5’-GCGCAGCGC-3’ в изучаемых субстратах только в двух случаях (дорожки 3 и 9), когда центральный пентануклеотид последовательности содержит только 2 метилированных цитозина, что соответствует ранее установленной субстратной специфичности PkrI [5]. При этом PkrI расщепляет плазмиды pHspAI12 и pHspAI10, модифицированные метилазой M.Fsp4HI, не только при наличии 4-х 5-метилцитозинов в центральном пентануклеотиде, но также и по модифицированному сайту 5'-GCNGC-3'/3'-CGNCG-5', содержащему три 5-метилцитозина.
Таким образом, МД-эндонуклеаза MteI узнает протяжённую С5-метилированную последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)AG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GT(5mC)G(5mC)G-5’ и существенно отличается по субстратной специфичности от ранее описанных МД-эндонуклеаз BisI, BlsI, GluI и PkrI, которые узнают модифицированную последовательность 5’-GCNGC-3’/3’-CGNCG-5’ при наличии в ней от 2-х до 4-х 5-метилцитозинов.

 

Рис. 3. Сравнение активности MteI при расщеплении различных плазмид. Определение активности фермента проводилось стандартным образом путем гидролиза препаратов ДНК несколькими разведениями фермента: реакционную смесь с 1 мкл препарата MteI последовательно разбавляли в два, четыре и восемь раз реакционной смесью без фермента. Время реакции – 1 час.

Дорожки:

a) 1 – pHspAI10/DriI; 2 - pHspAI12/DriI; 3 - pHspAI4/DriI+M.Fsp4HI; 4 - pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI; 5 - pHspAI12/DriI+M.Fsp4HI; 6 – pHspAI10/DriI + 1 мкл MteI; 7 - pHspAI10/DriI + 1/2 мкл MteI; 8 - pHspAI10/DriI + 1/4 мкл MteI; 9 - pHspAI10/DriI + 1/8 мкл MteI; 10 - маркер молекулярного веса ДНК; 11 – pHspAI12/DriI + 1 мкл MteI; 12 - pHspAI12/DriI + 1/2 мкл MteI; 13 - pHspAI12/DriI + 1/4 мкл MteI; 14 - pHspAI12/DriI + 1/8 мкл MteI; 15 – pHspAI4/DriI + M.Fsp4HI + 1 мкл MteI; 16 – pHspAI4/DriI + M.Fsp4HI + 1/2 мкл MteI; 17 – pHspAI4/DriI + M.Fsp4HI + 1/4 мкл MteI; 18 – pHspAI4/DriI + M.Fsp4HI + 1/8 мкл MteI;
б) 1 – pHspAI10/DriI + M.Fsp4HI + 1 мкл MteI; 2 – pHspAI10/DriI + M.Fsp4HI + 1/2 мкл MteI; 3 – pHspAI10/DriI + M.Fsp4HI + 1/4 мкл MteI; 4 – pHspAI10/DriI + M.Fsp4HI + 1/8 мкл MteI; 5 – pHspAI10/DriI + M.Fsp4HI + 1/16 мкл MteI; 6 – pHspAI10/DriI + M.Fsp4HI + 1/32 мкл MteI; 7 - маркер молекулярного веса ДНК; 8 – pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI + 1 мкл MteI; 9 – pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI + 1/2 мкл MteI; 10 – pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI + 1/4 мкл MteI; 11 – pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI + 1/8 мкл MteI; 12 – pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI + 1/16 мкл MteI; 13 – pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI + 1/32 мкл MteI; 14 - маркер молекулярного веса ДНК.

На рисунке 3 представлены результаты более детального определения активности MteI при гидролизе линейной формы плазмид pHspAI10 и pHspAI12, а также плазмид pHspAI4, pHspAI10 и pHspAI12, модифицированных метилазой Fsp4HI.
Как видно из этого рисунка, наименьшую активность MteI проявляет при гидролизе pHspAI4, модифицированной метилазой M.Fsp4HI (рис.3а, дорожки 15-18). Этот результат соответствует сделанному выше заключению, что последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)AG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GT(5mC)G(5mC)G-5’ является минимальным сайтом и хуже остальных субстратов расщепляется ферментом MteI. Немного лучшим субстратом является последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)GCAG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G(5mC)GTCG(5mC)G-5’ в плазмиде pHspAI12 (рис.3а, дорожки 11-14). Фермент MteI не расщепляет полностью линейную форму обеих этих плазмидных ДНК (рис 3а, дорожки 11 и 15) и, таким образом, при их гидролизе проявляет активность меньше одной единицы в микролитре. Существенно большую активность (2 единицы в микролитре в пересчёте на рассматриваемый субстрат) мы наблюдаем при расщеплении последовательности 5’-G(5mC)G(5mC)GCAG(5mC)G(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G(5mC)GTCG(5mC)G(5mC)G-5’в плазмиде pHspAI10 (рис.3а, дорожки 6-9). И, наконец, MteI проявляет активность 8 единиц в микролитре при расщеплении субстратов с последовательностями G(5mC)G(5mC)G(5mC)AG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G(5mC)GT(5mC)G(5mC)G-5’ и 5’-G(5mC)G(5mC)G(5mC)AG(5mC)G(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)G(5mC)GT(5mC)G(5mC)G(5mC)G-5’ в плазмидах pHspAI12 и pHspAI10, соответственно, модифицированных метилазой M.Fsp4HI. Полученные результаты суммированы в таблице 1.

 

Метилированная последовательность	Плазмида с сайтом узнавания MteI	Количество 5-метилцитозинов в метилированной последовательности	Активность MteI при гидролизе плазмидной ДНК
5’-G(5mC)G CAG(5mC)G C-3’ 3’-C G(5mC)GTC G(5mC)G-5’	pHspAI4	4	-
5’-G(5mC)G(5mC)G CAG(5mC)G C-3’ 3’-C G(5mC)G(5mC)GTC G(5mC)G-5’	pHspAI12	6	< 1 ед/мкл
5’-G(5mC)G(5mC)A G(5mC)G C-3’ 3’-C G(5mC) G T(5mC)G(5mC)G-5’	pHspAI4/M.Fsp4HI	6	< 1 ед/мкл
5’-G(5mC)G(5mC)G CAG(5mC)G(5mC)G C-3’ 3’-C G(5mC)G(5mC)GTC G(5mC)G(5mC)G-5’	pHspAI10	8	2 ед/мкл
5’-G(5mC)G(5mC)G(5mC)A G(5mC)G C-3’ 3’-C G(5mC)G(5mC)G T(5mC)G(5mC)G-5’	pHspAI12/M.Fsp4HI	8	8 ед/мкл
5’-G(5mC)G(5mC)G(5mC)A G(5mC)G(5mC)G C-3’ 3’-C G(5mC)G(5mC)G T(5mC)G(5mC)G(5mC)G-5’	pHspAI10/M.Fsp4H	10	8 ед/мкл

Таблица 1.
Активность MteI в реакции гидролиза субстратных ДНК, содержащих ген метилазы M.HspAI.

На основе полученных данных в качестве канонического субстрата для MteI нами была выбрана ДНК плазмиды pHspAI10, линеаризованная рестриктазой DriI и модифицированная метилазой M.Fsp4HI. Таким образом, за одну единицу активности MteI мы принимаем такое минимальное количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза единственного сайта узнавания в 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI в 20 мкл реакционной смеси, содержащей SE-буфере «Y» при 48°С за 60 минут. Активность исследуемого препарата MteI при гидролизе канонического субстрата составляет 8 единиц в микролитре.

 

Гидролиз субстратных ДНК, содержащих ген метилазы M.Fsp4H

В качестве возможного субстрата MteI мы проверяли также ряд плазмид, содержащих ген метилазы Fsp4HI (см. Материалы и методы). На рисунке 4 приведены результаты гидролиза линейной формы этих плазмид и pHspAI10 ферментом MteI.

 

 

Рис. 4. Гидролиз MteI субстратных ДНК, содержащих ген метилазы M.Fsp4H.

Дорожки:

1 – pFsp4HI3/DriI; 2 – pFsp4HI3/DriI+MteI; 3 – pFsp4HI4/DriI; 4 – pFsp4HI4/DriI+MteI; 5 – pFsp4HI6/DriI; 6 – pFsp4HI6/DriI+MteI; 7 – pFsp4HI8/DriI; 8 – pFsp4HI8/DriI+MteI; 9 – pHspAI10/DriI; 10 – pHspAI10/DriI+MteI; 11 – маркер молекулярного веса ДНК.

 

Как видно из этого рисунка, MteI не расщепляет ДНК плазмид pFsp4HI4 (дорожка 4), pFsp4HI6 (дорожка 6) и pFsp4HI8 (дорожка 8).
Таким образом, последовательность 5’-G(5mC)CG(5mC)AG(5mC)CGC-3’/3’-CGG(5mC)GT(5mC)GG(5mC)G-5’, которая имеется в составе pFsp4HI6, не является субстратом MteI (дорожка 6), хотя его центральная подчеркнутая часть совпадает с центральной частью гидролизуемого сайта в плазмиде pHspAI4, метилированной метилазой Fsp4HI.
Из полученных результатов и анализа данных в таблице 1 следует, что фермент MteI способен расщеплять последовательность 5’-G(5mC)AG(5mC)-3’/3’-(5mC)GT(5mC)G-5’ при наличии дополнительного G(5mC)-динуклеотида на 5'-конце верней и нижней цепи, что и приводит к формуле минимального сайта 5’-G(5mC)G(5mC)AG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GT(5mC)G(5mC)G-5, являющегося наиболее плохим субстратом фермента. В тоже время MteI проявляет существенно большую активность при замене в сайте узнавания 5’-GC-3’ динуклеотидов на 5’-G(5mC)-3’ динуклеотиды и появлении дополнительных 5’-G(5mC)-3’ динуклеотидов на 5'-концах нонануклеотида в обеих цепях ДНК. Следует отметить при этом, что метилирование метилазой Fsp4HI цитозинов, прилегающих к центральному нуклеотиду узнаваемой последовательности (A или T) также приводит к значительному увеличению активности MteI.

 

Гидролиз ферментом MteI ДНК фага λ, метилированной метилазами HspAI и Fsp4HI

Дальнейшее определение субстратной специфичности MteI проводилось нами при использовании в качестве субстрата ДНК фага λ, последовательно метилированной метилазами HspAI и Fsp4H. Результаты этого анализа представлены на рис. 5.

 

Рис. 5. Гидролиз ДНК фага λ, метилированной метилазами HspAI и Fsp4HI. Время реакции – 30 минут. Объём реакционной смеси – 20 мкл.

Дорожки:

1 – ДНК фага λ/M.HspAI+M.Fsp4HI; 2 – ДНК фага λ/M.HspAI+M.Fsp4HI+HspAI; 3 – ДНК фага λ/M.HspAI+M.Fsp4HI+Fsp4HI; 4 – маркер молекулярного веса ДНК; 5 -ДНК фага λ/M.HspAI+M.Fsp4HI + 4 ед. активости MteI; 6 – ДНК фага λ/M.HspAI+M.Fsp4HI + 2 ед. активости MteI; 7 – ДНК фага λ/M.HspAI+M.Fsp4HI + 1 ед. активости MteI; 8 – ДНК фага λ/M.HspAI+M.Fsp4HI + 0,5 ед. активности MteI.

 

Полнота метилирования ДНК фага λ метилазами HspAI и Fsp4H проверялась по блокированию гидролиза рестриктазами HspAI (дорожка 2) и Fsp4HI (дорожка 3), соответственно. Из рис. 5 видно, что при добавлении в реакционную смесь 4, 2, 1 и 0,5 единиц активности MteI (дорожки 4, 5, 6, 7, соответственно) на электофореграмме наблюдается появление трех полос продуктов гидролиза. Анализ структуры ДНК показывает, что в нуклеотидной последовательности ДНК фага λ в положении 2498 - 2506 находится последовательность 5’-GCGCTGCGC-3’, а в позиции 5437 - 5445 лежит сайт 5’-GCGCGGCGC-3’. При обработке ДНК фага λ метилазами HspAI и Fsp4H в первом случае образуется последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)AG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GT(5mC)G(5mC)G-5’, тогда как во втором случае образуется последовательность 5’-G(5mC)G(5mC)GG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GC(5mC)G(5mC)G-5’. Данные последовательности соответствуют минимальному сайту MteI, определенному выше. Как видно из рисунка 5, электрофоретическая подвижность образующихся фрагментов ДНК (~2500 и ~2940 п.н.), соответствует продуктам гидролиза субстратной ДНК по позициям 2498 и 5437. Наблюдаемая менее яркая третья полоса длиной ~5500 п.н, образуется, вероятно, из первых двух вследствие неполного гидролиза сайта в позиции 2498.
Таким образом, из полученных данных по гидролизу метилированной ДНК фага λ и различных плазмидных ДНК можно сделать вывод о том, что MteI расщепляет минимальный сайт 5’-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5’.

 

Определение позиции гидролиза ДНК эндонуклеазой MteI

Для подтверждения установленной последовательности узнавания и определения позиций расщепления ДНК в сайте узнавания мы проводили гидролиз ферментом MteI олигонуклеотидных дуплексов.

 

 

Рис. 6. Определение позиции гидролиза ДНК ферментом MteI на дуплексах Mte3/Mte4 (а) и Glu7/Glu8 (б). Электрофорез в 20% ПААГ с 7 М мочевиной. Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором [³²P] по 5'-концу, обозначены знаком *.

Дорожки:

(а) 1 – Mte3*/Mte4; 2 – Mte3*/Mte4 + MteI; 3 – Mte3*/Mte4 + ExoIII; 4 – Mte3*/Mte4 + GluI; 5 – Mte4*/Mte3; 6 – Mte4*/Mte3 + MteI; 7 – Mte4*/Mte3 + ExoIII; 8 – Mte4*/Mte3+ GluI.
(б) 1 – Glu7*/Glu8; 2 – Glu7*/Glu8 + MteI; 3 – Glu7*/Glu8 + ExoIII; 4 – Glu7*/Glu8 + GluI; 5 – Glu8*/Glu7; 6 – Glu8*/Glu7 + MteI; 7 – Glu8*/Glu7 + ExoIII; 8 – Glu8*/Glu7+ GluI.

 

Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой MteI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазами MteI и GluI олигонуклеотидных дуплексов Mte3/Mte4 (содержит A/T пару в центре сайта MteI) и Glu7/Glu8 (содержит G/C пару в центре). В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ExoIII.
На рис. 6а изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления дезоксирибоолигонуклеотидного радиоактивно меченного дуплекcа Mte3/Mte4 в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. А на рис. 6б приведен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления радиоактивно меченного дуплекcа Glu7/Glu8 в тех же условиях.
Из рис. 6а видно, что продукты гидролиза ДНК дуплекса Mte3*/Mte4 на дорожках 2 и 4, а также дуплекса Mte4*/Mte3 на дорожках 6 и 8 имеют одинаковые длины. То же можно сказать про полосы на рис. 6б (дор. 2 и 5 для дуплекса Glu7*/Glu8 и дор. 7 и 10 для дуплекса Glu8*/Glu7). Из данных, приведенных на рисунке 6, следует, что MteI расщепляет ДНК перед центральным нуклеотидом N в последовательности: 5’-G(5mC)G(5m C)^NG(5mC)G(5mC)-3’ и позиции гидролиза ДНК ферментами GluI и MteI совпадают

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная в данной работе новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза MteI имеет минимальный сайт узнавания 5’-G(5mC)G(5mC)^NG(5mC)GC-3’/3’-CG(5mC)GN^(5mC)G(5mC)G-5’ и расщепляет ДНК как указано стрелками. Замена в сайте узнавания 5’-GC-3’ динуклеотидов на 5’-G(5mC)-3’ динуклеотиды и появлении дополнительных 5’-G(5mC)-3’ динуклеотидов на 5'-концах нонануклеотида в обеих цепях ДНК приводит к значительному возрастанию активности фермента.
Ранее для ряда МД-эндонуклеаз нами было показано существенное увеличение их активности при замене цитозинов на 5-метилцитозины в сайте узнавания, который является совершенно определенным по размерам [3], [6]. Однако в случае MteI мы наблюдаем значительное увеличение активности фермента при расширении сайта узнавания и появлении в обеих цепях дополнительных 5-метилцитозинов. Такое явление значительного возрастания активности фермента с увеличением размеров его сайта узнавания является новым для МД-эндонуклеаз и мы планируем его детальное исследование в последующих работах.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Тарасова Г.В., Наякшина Т.Н., Дегтярев С.Х // Субстратная специфичность новой ДНК-эндонуклеазы GlaI // BMC Molecular Biology 2008, 9:7 (интернет-версия)
2. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis Т30 узнает метилированную последовательность ДНК 5’G(5mC)^NGC-3’ // Биотехнология. – 2005. - №3. – С.22-26. (интернет-версия)
3. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнаёт последовательности ДНК 5’-G(5mC)NGC-3’ и расщепляет её с образованием 3’-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2007. – Т.3. – №1. – С.28-33. (интернет-версия)
4. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфичесчкая эндонклеаза GluI узнаёт метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN(5mC)G-5’ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2007. – Т.3. – №2. – С.13-17. (интернет-версия)
5. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Томилова Ю.Э., Тарасова М.В., Михненкова Н.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая метилзависимая ДНК-эндонуклеаза PkrI узнаёт и расщепляет метилированную последовательность ДНК 5’-GCN^GC-3’/3’-CG^NCG-5’, содержащую не менее трёх 5-метилцитозинов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2011. - Т.7. - №3. - С.35-41. (интернет-версия)
6. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнаёт метилированную последовательность 5’-GCGC-3’. // Биотехнология. – 2006. – №4. – С.31–35. (интернет-версия)
7. Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Дегтярёв С.Х. Зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов в узнаваемой последовательности 5’-GCGC-3’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2006. - Т.2. - №1. - С.30-39. (интернет-версия)
8. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж. Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. – М., 1997.
9. Madden T.L., Tatusov R.L., Zhang J. Applications of network BLAST server. // Meth. Enzymol. – 1996. - V.266 – P.131-141.
10. Smith H.O., Nathans D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol.81. - P.419-423.
11. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Охапкина С.С., Гончар Д.А., Дедков В.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология. 2007. т.41, №1. С. 43-50.