function keepAlive() { var myAjax = new Request({method: "get", url: "index.php"}).send();} window.addEvent("domready", function(){ keepAlive.periodical(3600000); });
Главная  //  Научные статьи  //  Новые ферменты  //  Новая эндонуклеаза рестрикции AluBI из Arthrobacter luteus B- изошизомер AluI, нечувствительный к присутствию 5-метилцитозина в сайте узнавания AGCT

Новая эндонуклеаза рестрикции AluBI из Arthrobacter luteus B- изошизомер AluI, нечувствительный к присутствию 5-метилцитозина в сайте узнавания AGCT

 

Чернухин В.А., Болтенгаген А.А., Тарасова Г.В, Дедков В.С., Дегтярёв С.Х

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2007. – Т. 3 №1. – С. 21-27

 

Описаны свойства новой эндонуклеазы рестрикции, AluBI, узнающей и расщепляющей последовательность AGCT и являющейся изошизомером хорошо известной рестриктазы AluI. Фермент AluBI, в отличие от AluI, расщепляет ДНК в случае, когда цитозиновые основания в сайте узнавания метилированы в положение С5. AluBI также расщепляет последовательность узнавания с одним С5-метилированным и другим N4-метилированным цитозинами, однако не расщепляет ДНК при модификации обоих цитозинов в положение N4.

 

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы, ЭР) являются сайт-специфическими ДНК-эндонуклеазами бактерий и, как правило, входят в состав так называемых систем рестрикции-модификации. В настоящее время описано более 250 различных сайтов узнавания ЭР второго типа и более 2000 различных изошизомеров рестриктаз, т.е. аналогов ранее обнаруженных ферментов, которые в свою очередь называются прототипами. Хотя изошизомеры и прототип имеют одинаковый сайт узнавания, они могут отличаться по способности гидролизовать узнаваемую последовательность ДНК при наличии в ней метилированных оснований. Использование изошизомеров, отличающихся по способности гидролизовать модифицированную ДНК, нашло широкое применение при изучении статуса метилирования природных ДНК [1-5,16]. Однако, известно всего несколько примеров таких пар изошизомеров (EcoRII - MvaI [6,7], HpaII-MspI [8]), используемых в практике исследований.
ЭР AluI из штамма бактерии Arthrobacter luteus, узнающая и расщепляющая последовательность AGCT, известна уже более 30 лет [9]. Этот фермент нашёл широкое практическое применение в биотехнологии и молекулярной биологии и стал одной из наиболее широко используемых эндонуклеаз рестрикции.
Помимо эндонуклеазы рестрикции в систему рестрикции-модификации (РМ-систему) AluI входит ДНК-метилтрансфераза, которая метилирует 5-ое положение цитозина в узнаваемой последовательности AGCT [14]. Такая модификация предотвращает гидролиз собственной ДНК Arthrobacter luteus эндонуклеазой рестрикции AluI, тогда как чужеродная неметилированная ДНК расщепляется рестриктазой AluI.
В данной работе описаны выделение и свойства новой эндонуклеазы рестрикции AluBI, способной расщеплять как немодифицированную ДНК, так и сайт узнавания AGCT, метилированный по 5-му положению цитозина.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались реактивы производства "Sigma" (США), "Serva" (Германия), "ICN" (США) и "Хеликон"(Россия).

 

Выращивание штамма и выделение фермента

Колонии Arthrobacter luteus B выращивали на агаризованной среде ЛБ и затем переносили в колбы, содержащие 300 мл жидкой питательной среды ЛБ, и культивировали на качалках при 30°С и перемешивании - 150 об/мин в течение двух суток до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждали в течение 30 минут в роторе JA-6 на центрифуге J2-21 (Beckman, США) при 5000 об/мин и температуре 4°С. Выход биомассы составил 5 г/л среды.
Выделение фермента проводили при 4°С путём колоночной хроматографии.
37 г замороженной биомассы суспендировали в 100 мл буфера А (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол), содержащем 0,05 М NaCl, 0,3 мг/мл лизоцим, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PSMF), и инкубировали в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Далее клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали в течение 30 мин в роторе JA-20 при 15000 об/мин.
Супернатант пропускали через колонку с фосфоцеллюлозой P-11 ("Whatman", Англия) объёмом 45 мл, предварительно уравновешенную буфером А, содержащем 0,05 М NaCl, затем белок элюировали линейным градиентом NaCl (0,05 М - 0,6 М) в буфере А объёмом 500 мл, собирая фракции по 10 мл. Фракции, содержащие эндонуклеазу, объединяли, диализовали против 20 объёмов буфера А и наносили на колонку с 7 мл гепарин-сефарозы ("Bio-Rad", США). Элюцию проводили линейным градиентом NaCl (0,05 М - 0,5 М) в буфере А объёмом 120 мл, собирая фракции по 3 мл. Активные фракции объединяли и наносили на колонку с гидроксилапатитом объёмом 4 мл, предварительно уравновешенную буфером В (0,01 М K2HPO4, pH 7,2, 7 мМ β-меркаптоэтанол). Колонку промывали 10 мл буфера В и проводили элюцию линейным градиентом, собирая фракции объёмом по 2 мл. Активные фракции объединяли и диализовали против 20 объёмов концентрирующего буфера (50% глицерин, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,55, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,05 М NaCl). Препарат хранили при -20°С.
Выход фермента составил 2,5 мл препарата с концентрацией 5000 ед./мл.

 

Препараты ферментов

Для экспериментов использовали эндонуклеазы рестрикции AluI (концентрация 3000 ед./мл), AluB I (концентрация 3000 ед./мл), T4 полинуклеотидкиназу и буферные растворы производства НПО "Сибэнзим" (Россия).

 

Определение чувствительности ферментов к метилированию сайта узнавания на синтетических олигонуклеотидных дуплексах

Олигодезоксирибонуклеотиды следующего состава, служившие субстратом для эндонуклеаз Alu I и AluB I, были синтезированы в НПО "Сибэнзим" (Россия).

Alu1: 5'-GGT ATA GGA TGA AGCT TTC GCG GGT TAA GG-3'
Alu2: 5'-CC TTA ACC CGC GAA AGCT TCA TCC TAT TCC-3'
Alu3: 5'-GGT ATA GGA TGA (6mA)GCT TTC GCG GGT TAA GG-3'
Alu4: 5'-CC TTA ACC CGC GAA (6mA)GCT TCA TCC TAT TCC-3'
Alu5: 5'-GGT ATA GGA TGA AG(5mC)T TTC GCG GGT TAA GG-3'
Alu6: 5'-CC TTA ACC CGC GAA AG(5mC)T TCA TCC TAT TCC-3'
Alu7: 5'-GGT ATA GGA TGA AG(4mC)T TTC GCG GGT TAA GG-3'
Alu8: 5'-CC TTA ACC CGC GAA AG(4mC)T TCA TCC TAT TCC-3'


Олигонуклеотиды с чётным номером комплементарны олигонуклеотидам с нечётным номером. Все олигонуклеотидные дуплексы имеют одинаковую первичную структуру и отличаются друг от друга наличием или отсутствием метилированного основания в последовательности AGCT (сайт AGCT, узнаваемый AluI и AluBI, подчеркнут)

 

Приготовление γ-[32P]ATP-меченых олигонуклеотидных дуплексов

Одну из цепей олигонуклеотидного дуплекса модифицировали по 5'-концу с помощью Т4-полинуклеотидкиназы и γ-[32P]ATP. После очистки олигонуклеотида от побочных продуктов реакции к нему добавляли комплементарный немеченый олигонуклеотид и пробирку прогревали 2 минуты при 65°С с последующим охлаждением до комнатной температуры на рабочем столе.

 

Гидролиз олигонуклеотидных дуплексов эндонуклеазами Alu I и AluB I

Реакцию гидролиза проводили добавлением 1 мкл препарата фермента AluI или AluBI, содержащего 3 единицы активности, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей SE-буфер (33 mM Tris ацетат pH 7.9 (при температуре 25°С), 10 mM Mg(CH3COO)2, 66mM KCH3COO, 1mM DTT) и олигонуклеотидный дуплекс в концентрации 66,7 нМ при температуре 37°С в течение 50 мин.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Описание штамма

Штамм Arthrobacter luteus B был выделен из природных изолятов в ходе поиска продуцентов рестриктаз, как описано ранее [10].
Штамм Arthrobacter luteus B характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки. На среде Лурия-Бертрани образует белые, гладкие, блестящие, непрозрачные, выпуклые, круглые колонии 4 мм в диаметре. Клетки кокковидные, диаметром 0,8-1,2 мкм, одиночные, в парах или в коротких цепочках.
Физиолого-биохимические признаки. Таксономическая принадлежность штамма-продуцента рестриктазы AluBI, определялась по его морфологическим и биохимическим свойствам, как описано ранее [11]. Клетки бактерии грамположительные. Не способны к анаэробному росту, каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Растут при температуре 10-40°С. Содержание гуанина и цитозина в ДНК штамма, установленное с помощью ранее предложенного метода [12], составляет 73-77%.
На основании анализа морфологических и биохимических свойств штамм идентифицировали как вид бактерии Arthrobacter luteus B, а продуцируемую им эндонуклеазу рестрикции назвали AluBI согласно общепринятой номенклатуре [13].

 

Определение специфичности эндонуклеазы рестрикции AluI

Специфичность фермента определяли по картинам расщепления различных ДНК (рис. 1).

b_320_200_16777215_00_Pics_paper30_fig1.jpg

 

Рис. 1. Гидролиз ДНК фагов лямбда и Т7 эндонуклеазами рестрикции AluI и AluBI.
Дорожки:
1 - ДНК фага λ;
2 - ДНК фага λ, ЭР AluI;
3 - ДНК фага λ, ЭР AluBI;
4 - ДНК фага Т7;
5 - ДНК фага Т7, ЭР AluI;
6 - ДНК фага Т7, ЭР AluBI;
7 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим).



В качестве субстратов для выявления специфичности расщепления использовали ДНК фагов λ и Т7. После инкубации в оптимальных условиях (37°С, SE-буфер Y - 33 мМ Tris-ацетат, pH 7,9, 10 мМ MgCl2, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ DTT) в течение 60 мин при концентрации ДНК 0,02 мг/мл продукты реакции разделяли путем электрофореза в 1% агарозном геле.
На рис. 1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК фагов λ и Т7эндонуклеазами рестрикции AluI и AluBI.
Из рис. 1 видно, что при обработке ДНК фагов λ и Т7 эндонуклеазами рестрикции AluI и AluBI образуются фрагменты одинаковой длины. Эти результаты говорят о том, что AluI и AluBI узнают и расщепляют одну и ту же последовательность ДНК.

 

Определение позиций расщепления ДНК сайт-специфической эндонуклеазой AluBI

Определение позиций расщепления ДНК сайт-специфической эндонуклеазой AluBI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении олигонуклеотидных дуплексов Alu1*/ Alu2 и Alu2*/ Alu1(меченая цепь помечена символом <*>), имеющих неметилированную последовательность узнавания AGCT, эндонуклеазами рестрикции AluI и AluBI. В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ExoIII. Результаты расщепления данных олигонуклеотидных дуплексов приведены на рис. 2.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper30_fig2.jpg

 

Рис. 2. Определение места расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции AluBI.
Дорожки:
1 - дуплекс Alu1*/ Alu2;
2, 5 - дуплекс Alu1*/ Alu2, экзонуклеаза III из E.coli;
3 - дуплекс Alu1*/ Alu2, ЭР AluI;
4 - дуплекс Alu1*/ Alu2, ЭР AluBI;
6 - дуплекс Alu2*/ Alu1;
7, 10 - дуплекс Alu2*/ Alu1, экзонуклеаза III из E.coli;
8 - дуплекс Alu2*/ Alu1, ЭР AluI;
9 - дуплекс Alu2*/ Alu1, ЭР AluBI;



Как видно из рис. 2, длины фрагментов, образованных при гидролизе олигонуклеотидных дуплексов Alu1*/Alu2 и Alu2*/Alu1 обоими ферментами, одинаковы. Таким образом, эндонуклеаза рестрикции AluBI расщепляет сайт узнавания в той же позиции, что и AluI, то есть после гуанина.

Определение и сравнение чувствительности ферментов к метилированию сайта узнавания AluI и AluBI Результаты расщепления метилированных и неметилированных синтетических олигонуклеотидных дуплексов приведены на рис. 3-5.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper30_fig3.jpg

Рис. 3. Определение чувствительности ферментов AluI и AluBI к метилированным основаниям в сайте узнавания
Дорожки:
1 -дуплекс Alu1*/ Alu2; 2 - дуплекс Alu1*/ Alu2, ЭР AluI;
3 - дуплекс Alu1*/ Alu2, ЭР AluBI; 4 - дуплекс Alu1*/ Alu4, ЭР AluI;
5 - дуплекс Alu1*/ Alu4, ЭР AluBI; 6 - дуплекс Alu1*/ Alu6, ЭР AluI;.
7 - дуплекс Alu1*/ Alu6, ЭР AluBI; 8 - дуплекс Alu1*/ Alu8, ЭР AluI;
9 - дуплекс Alu1*/ Alu8, ЭР AluBI;



На рис. 3 приведена электрофореграмма продуктов расщепления ферментами AluI и AluBI олигонуклеотидных дуплексов, содержащих сайт узнавания этих ферментов либо без метилированных оснований либо только с одним метилированным основанием (полуметилированный сайт). Как видно из рис. 3, AluI и AluBI, расщепляют олигонуклеотидный дуплекс, содержащий неметилированный сайт узнавания (дорожки 2, 3). Однако оба фермента не способны расщеплять ДНК, если в сайте узнавания в комплементарной цепи метилирован аденозин (дорожки 4, 5). При наличии в комплементарной цепи метилированного в 4-ое или 5-ое положение цитозина, AluBI расщепляет немодифицированную цепь (дорожки 7, 9), тогда как AluI не расщепляет (дорожки 6, 8).

b_320_200_16777215_00_Pics_paper30_fig4.jpg

 Рис. 4. Определение чувствительности ферментов AluI и AluBI к метилированным основаниям в сайте узнавания
Дорожки:
1 -дуплекс Alu5*/ Alu2; 2 - дуплекс Alu5*/ Alu2, ЭР AluI;
3 - дуплекс Alu5*/ Alu2, ЭР AluBI; 4 - дуплекс Alu5*/ Alu6, ЭР AluI;
5 - дуплекс Alu5*/ Alu6, ЭР AluBI; 6 - дуплекс Alu5*/ Alu4 ЭР AluBI;
7 - дуплекс Alu5*/ Alu4, ЭР AluI; 8 - дуплекс Alu5*/ Alu8, ЭР AluI;
9 - дуплекс Alu5*/Alu8, ЭР AluBI;

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper30_fig5.jpg

Рис. 5. Определение чувствительности ферментов AluI и AluBI к метилированным основаниям в сайте узнавания
Дорожки:
1 -дуплекс Alu7*/ Alu2; 2 - дуплекс Alu7*/ Alu2, ЭР AluI;
3 - дуплекс Alu7*/ Alu2, ЭР AluBI; 4 - дуплекс Alu7*/ Alu8, ЭР AluI;
5 - дуплекс Alu7*/ Alu8, ЭР AluBI; 6 - дуплекс Alu7*/ Alu6, ЭР AluI;
7 - дуплекс Alu7*/ Alu6, ЭР AluBI; 8 - дуплекс Alu7*/ Alu4, ЭР AluI;
9 - дуплекс Alu7*/ Alu4, ЭР AluBI;



На рис. 4 и 5 приведены электрофореграммы продуктов расщепления ферментами AluI и AluBI олигонуклеотидных дуплексов, гидролизуемая цепь которых содержит 5-метилцитозин (рис. 4) или N4-метилцитозин (рис. 5) в сайте узнавания. Как видно из рис. 4, AluBI расщепляет цепь с 5-метилцитозином, если комплементарная цепь немодифицирована (дорожка 3) или содержит 5-метилцитозин в сайте узнавания (дорожка 5); при этом AluI такую метилированную ДНК не расщепляет (дорожки 2, 4). Таким образом, AluBI в отличие от AluI гидролизует обе цепи ДНК в сайте узнавания при наличии в нём одного или двух 5-метилцитозиновых оснований. Однако цепь с 5-метилцитозином не гидролизуется AluI и AluBI, если комплементарная цепь ДНК содержит в сайте узнавания N6-метиладенин (дорожки 6, 7). И, наконец, AluBI в отличие от AluI, расщепляет цепь с 5-метилцитозином при наличии N4-метилцитозина в комплементарной цепи (дорожки 8, 9).

Как видно из рис. 5, AluBI, в отличие от AluI, гидролизует цепь с N4-метилцитозином в сайте узнавания, если комплементарная цепь не модифицирована (дорожки 2 и 3). Однако как AluI, так и AluBI не расщепляют олигонуклеотид, если он содержит два N4-метилцитозина в сайте узнавания (дорожки 4, 5). Таким образом, AluBI, в отличие от AluI, способен расщеплять ДНК, если узнаваемая последовательность содержит только один N4-метилцитозин. Цепь с N4-метилцитозином также гидролизуется ферментом AluBI, но не AluI, если комплементарная цепь узнаваемой последовательности содержит 5-метилцитозин (дорожки 6 и 7). При этом, как и следовало ожидать, олигонуклеотид не расщепляется обоими ферментами, если в состав его сайта узнавания входит N6-метиладенин (дорожки 8 и 9).
Таким образом, в отличие от AluI, ЭР AluBI способна расщеплять ДНК, если в сайте узнавания метилированы один или два цитозина в положении С5 или один цитозин в положении N4.

 

Возможности использования ЭР Alu и AluBI для определения статуса метилирования хромосомных ДНК и для избирательного гидролиза С5-метилированных ДНК

Благодаря различной чувствительности ферментов AluI и AluBI к сайтам узнавания, содержащим 5-метилцитозин, эта пара эндонуклеаз рестрикции может использоваться для определения модифицированных оснований в последовательности 5'-AGCT-3' в хромосомных ДНК.
Известно [14], что хромосомная ДНК штамма Arthrobacter luteus - продуцента AluI - содержит 5-метилцитозин в сайте 5'-AGCT-3'. В соответствии с описанными выше свойствами ферментов AluI и AluBI, хромосомная ДНК Arthrobacter luteus - продуцента AluI - не гидролизуется рестриктазой AluI, но эффективно расщепляется рестриктазой AluBI (рис. 6).

b_320_200_16777215_00_Pics_paper30_fig6.jpg

 

 

Рис. 6. Расщепление хромосомной ДНК Arthrobacter luteus эндонуклеазами рестрикции AluI и AluBI.
Дорожки:
1 - хромосомная ДНК Arthrobacter luteus;
2 - хромосомная ДНК Arthrobacter luteus, ЭР AluI;
3 - хромосомная ДНК Arthrobacter luteus, ЭР AluBI;
4 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим).

 



Анализ статуса метилирования ДНК с помощью пары AluI и AluBI возможен также и для эукариотических геномов. Для некоторых из них показано образование 5-метилцитозина в результате метилирования последовательностей ДНК CNG [15] и СT [16]. В этом случае, при перекрывания этих сайтов метилирования с последовательностью AGCT, AluBI будет расщеплять модифицированную последовательность узнавания, тогда как AluI нет.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. McClelland, M., The effect of sequence specific DNA methylation on restriction endonuclease cleavage// Nucleic Acids Res. - 1981. - Vol.9 - P.5859-5866.
  2. McClelland M. and Nelson M. The effect of site specific methylation on restriction endonuclease digestion. // Nucleic Acids Res. - 1985. - Vol.13 (Suppl): P.201-207.
  3. McClelland, M., et al., Effect of site-specific modification on restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases. // Nucleic Acids Res. - 1994. - Vol.22. - P.3640-3659.
  4. Cooper D.N., Taggart M.H., Buildings K., Bird A.P. Unmethylated domains in vertebrate DNA. // Nucleic Acid Res. - 1983. - Vol.11. - P.647-658.
  5. Bird A., Taggard M., Frommer M., Miller O.J., Macleod D. A fraction of the mouse genome that is derived from islands of nonmethylated, CpG-rich DNA. // - Cell. - 1985. - Vol.40. - P.91-99.
  6. Buryanov, Ya.I., et al., Site specificity and chromatographic properties of E.coli K12 and EcoRII DNA-cytosine methylases. // FEBS Letters. - 1978. - Vol.88. - P.251-254.
  7. Butkus, V. et al., Investigation of restriction-modification enzymes from M.varians RFL19 with a new type of specificity toward modification of substrate. // Nucleic Acids Res. - 1985. - Vol.13. - P.5727-5746.
  8. Waalwijk, C., Flavell, R.A., MspI, an isochizomer of HpaII which cleaves both unmethylated and methylated HpaII sites // Nucleic Acids Res. - 1978. - Vol.5. - P.3231-3236.
  9. Roberts, R.J., Myers, P.A., Morrison, A., Murray, K. A specific endonuclease from Arthrobacter luteus.// J Mol Biol. - 1976. - Vol.102. - P.157-165.
  10. Белавин П.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. - 1988. - Т.24. - №1 - С.50-51. (интернет-версия)
  11. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж. Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. - М., 1997.
  12. Дедков В.С. Определение содержания G+C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции. // Биотехнология. - 2004. - № 4. - С.77 - 82.
  13. Smith, H.O., Nathans, D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol. 81. - P. 419 - 423.
  14. Zhang B, Tao T, Wilson GG, Blumenthal RM. The M.AluI DNA-(cytosine C5)-methyltransferase has an unusually large, partially dispensable, variable region. // Nucleic Acids Res. - 1993. - Vol.25. - P.905-911
  15. Naveh-Many T. and Cedar H. Topographical distribution of 5-methylcytosine in animal and plant DNA. Mol Cell Biol. - 1982. Vol.2. - P.758-762.
  16. Oakeley E.J. and Jost J.-P. Non-symmetrical cytosine methylation in tobacco pollen DNA // Plant Molecular Biology. - 1996. - Vol.31. - P.927-930

 

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ


ЭР - эндонуклеаза рестрикции,
Трис - трис-(оксиметил)-аминометан;
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.



Патент по данной работе находится в стадии оформления.