Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5’-G(5mC)^GC-3’.

Категория: Новые ферменты

Просмотров: 6963

Из бактериального штамма GL29 была выделена и охарактеризована новая эндонуклеаза рестрикции GlaI. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)↓GC-3’ и расщепляет ее, как указано стрелкой. Благодаря своей способности расщеплять только метилированную ДНК GlaI может найти практическое применение в генно-инженерных работах, а также для определения статуса метилирования ДНК эукариот.

ВВЕДЕНИЕ

Как правило, системы рестрикции-модификации (РМ) типа II включают два фермента - эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и ДНК-метилтрансферазу (М., МТазу). ЭР II-го типа узнают короткие специфические последовательности ДНК (длиной обычно 4-8 п.о.) и расщепляют ее внутри или вблизи сайта узнавания. Бактериальные МТазы метилируют сайт узнавания, защищая тем самым хозяйскую ДНК от расщепления собственным ферментом, тогда как чужеродная неметилированная ДНК расщепляется.
Однако известно несколько примеров бактерий, в которых эндонуклеаза рестрикции присутствует без соответсвующей МТазы. В большинстве случаев эти рестриктазы относятся к так называемому подтипу IIМ и расщепляют только метилированную ДНК. В настоящее время известно только два прототипа эндонуклеаз рестрикции подтипа IIМ, которые узнают и расщепляют только метилированную ДНК. Эндонуклеаза рестрикции DpnI узнает и расщепляет 5'-G(6mA)^TC-3' [1], фермент рестрикции BisI расщепляет 5'-G(5mC)↑NGC-3' [2].
В данной работе мы описываем новую эндонуклеазу рестрикции GlaI, которая узнает нуклеотидную последовательность 5'-G(5mC)↑GC-3', причем единственным кофактором является Mg²⁺. GlaI , подобно DpnI и BisI, принадлежит к подтипу IIМ [3].

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Выращивание штамма-продуцента

Выращивание штамма проводили в ферментёре объемом 20 литров (LKB, Швеция) при температуре 28°C в питательной среде, содержащей 1% триптон (Organotechnie, Франция), 0.5% дрожжевой экстракт (Organotechnie, Франция), 0.5% NaCl и 0.05% MgCl₂, при рН 7.5 с аэрацией 10 л/мин и перемешиванием 200 об/мин. При достижении культурой поздней логарифмической стадии роста клетки осаждали с помощью центрифугирования. В результате получили 100 г биомассы, которую хранили при -20°C.

Выделение фермента

Выделение фермента проводили при 4°C путем колоночной хроматографии. 100 г замороженной биомассы суспендировали в 300 мл буфера А (10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол), содержащем 0.1 М NaCl, 0.3 мг/мл лизоцим, 0.1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 0.1% тритон X-100, и инкубировали в течение 3 ч. при постоянном перемешивании. Далее клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали в течение 30 мин при 12000 об/мин.
Супернатант пропускали через колонку с фосфоцеллюлозой Р-11 ("Whatman", Англия) объёмом 100 мл, предварительно уравновешенную буфером А, содержащим 0.1 М NaCl. Колонку промывали 200 мл буфера А с 0.1 М NaCl, затем линейным градиентом NaCl (0.1-0.65 М) в буфере А объёмом 1000 мл, собирая фракции по 10 мл. Фракции, содержащие эндонуклеазу, объединяли, диализовали против 20 объёмов буфера А с 0.1 М NaCl и наносили на колонку с 15 мл гепарин-сефарозы ("Bio-Rad", США). Элюцию проводили линейным градиентом NaCl (0.05-0.45 М) в буфере А объёмом 300 мл, собирая фракции по 5 мл. Активные фракции объединяли и наносили на колонку с гидроксилапатитом объемом 4 мл, предварительно промытую уравновешивающим буфером (0.01 М K₂HPO₄, pH 7.2, 0.1 мM ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0.05 M NaCl). Колонку промывали 10 мл уравновешивающего буфера и проводили элюцию линейным градиентом в объеме 100 мл K₂HPO₄ (0.01-0.4 М) в уравновешивающем буфере, собирая фракции объемом по 2.5 мл. Активные фракции объединяли и диализовали против 20 объёмов концентрирующего буфера (50% глицерин, 0.05% тритон Х-100; 10 мМ Tris-HCl, pH 7.55, 0.1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0.1 М NaCl). Препарат хранили при -20°C.

Выявление активности фермента

В качестве субстрата для определения активности GlaI использовалась плазмида pHspAI. Данная плазмида была получена путем встраивания фрагмента ДНК штамма Haemophilus species A1, несущего ген HspAI ДНК метилтрансферазы, в плазмиду pUC19. Активность GlaI I определяли, проводя инкубацию в 50 мкл реакционной смеси, содержащей плазмиду pHspAI. Реакционная смесь включала 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI, 33 mM Трис-ацетат (pH 7.9), 10 mM MgCl₂, 66 mM ацетат калия и 1mM дитиотрейтол. После инкубирования в течение одного часа при 37°C реакция останавливалась добавлением 10 мкл стоп-буфера.
Одна единица активности фермента определялась как количество фермента, которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI при 37°C в течение 1 часа в 50 мкл реакционной смеси.

Определение сайта узнавания и позиций гидролиза ДНК

Сайт узнавания новой эндонуклеазы устанавливали путем сравнения картины гидролиза ДНК pHspAI ферментом GlaI с теоретически рассчитанной картиной расщепления этого же субстрата по сайту 5'-GCGC-3'.
Для достижения полного гидролиза ДНК высокоактивный препарат GlaI получали на концентраторе (Vivaspin 500, "Sartorius"). В результате получили препарат фермента с концентрацией 500 ед/мл. 2 мкл этого препарата вносили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI и инкубировали при 37°C в течение 1 часа.
Позиции гидролиза в сайте узнавания были установлены расщеплением [³²P]-меченных синтетических олигонуклеотидов ферментом GlaI. Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в 20% ПААГ в трис-боратном буфере, содержащем 7 М мочевину.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате выращивания штамма GL29 в питательном бульоне выход сырой биомассы составил 5 г клеток на 1 литр культуры. Очистку GlaI проводили как описано в разделе "Условия эксперимента". В результате было получено 1.8 мл препарата GlaI с активностью 100 ед/мл.
Эндонуклеаза GlaI не гидролизует стандартные вирусные и плазмидные ДНК, такие как ДНК фагов Лямбда (dam+/dcm+ и dam-/dcm-), Т7, аденовируса-2, плазмид pUC19 и pBR322. Мы также протестировали как возможные субстраты для GlaI некоторые плазмиды, содержащие гены других бактериальных метилаз, модифицирующих цитозиновые основания в ДНК: M.Fsp4HI (сайт узнавания 5'-GCNGC-3'), M.FauIA и M.FauIB (сайты узнавания 5'-CCCGC-3' и 5'-GCGGG-3', соответственно). Расщепления данных плазмид не происходило. При этом GlaI расщепляет ДНК плазмиды pHspAI, которая несет ген метилазы М.HspAI (узнаваемая последовательность 5'-GCGC-3'). Данная плазмида была получена лигированием EcoRI-фрагмента ДНК Haemophilus species A1, длиной 1.4 т.п.о и несущего ген МТазы HspAI, и плазмиды pUC19, линеаризованной по сайту EcoRI.
Первичная аминокислотная последовательность М.HspAI, полученная из нуклеотидной последовательности гена М.HspAI показывает высокую гомологию с M.HinP1I - 99% (рис. 1). Поскольку M.HinP1I метилирует С5-положения внутренних цитозиновых оснований в сайте 5'-GCGC-3' [4], мы сделали вывод, что М.HspAI также метилирует этот сайт с образованием 5'-G(5mC)GC-3' последовательностей, присутствующих в плазмиде pHspAI.

Рис. 1. Выравнивание первичных структур ДНК-метилтрансфераз HspAI и HinP1I. Идентичность последовательностей составляет 99%. Неидентичные аминокислотные остатки подчеркнуты

На рисунке 2 приведены результаты сравнительного расщепления плазмидных ДНК эндонуклеазами рестрикции GlaI и HspAI. Как видно из рисунка длины фрагментов ДНК, образующихся в результате гидролиза ДНК pHspAI, соответствуют предсказанным для случая расщепления эндонуклеазой рестрикции, узнающей сайт 5'-GCGC-3'. Эти данные показывают, что GlaI узнает и расщепляет нуклеотидную последовательность 5'-G(5mC)GC-3'.

Рис. 2. Сравнение длин фрагментов, образуемых при расщеплении плазмидных ДНК, эндонуклеазами GlaI и HspAI. Электрофорез в 2% агарозном геле.

Дорожки: 1 - ДНК плазмиды pUC19; 2 - ДНК плазмиды pUC19, обработанная рестриктазой HspAI; 3 - ДНК плазмиды pUC19, обработанная рестриктазой GlaI; 4 - ДНК плазмиды pHspAI; 5 - ДНК плазмиды pHspAI, обработанная рестриктазой HspAI; 6 - ДНК плазмиды pHspAI, обработанная рестриктазой GlaI; 7 - маркер молекулярного веса 1 Kb (СибЭнзим). В правом столбце приведены расчетные длины фрагментов ДНК, получаемых при расщеплении плазмиды pHspAI по сайтам 5'-GCGC-3'

Для окончательного подтверждения этих данных и определения места гидролиза ДНК, мы использовали синтетические олигонуклеотидные дуплексы, содержащие метилированный или неметилированный цитозиновый остаток (сайты 5'-GCGC-3' подчеркнуты):

    1: 5'-GTGCATGG(5mC)GCCTATGCG-3'
    2: 5'-CGCATAGG(5mC)GCCATGCAC-3'
    3: 5'-GTGCATGGCGCCTATGCG-3'
    4: 5'-CGCATAGGCGCCATGCAC-3'

Результаты расщепления этих олигонуклеотидных дуплексов представлены на рис. 3. Как видно из рисунка, метилированный дуплекс 1/2 расщепляется GlaI, тогда как дуплекс 3/4 с неметилированными цитозинами не расщепляется.
Для определения места расщепления ДНК эндонуклеазой GlaI проводили сравнение длин фрагментов, образуемых при расщеплении олигонуклеотидного дуплекса 3/4 рестриктазами GlaI и PspN4I (сайт узнавания 5'-GGNNCC-3'). Как видно из рисунка 3, фосфодиэфирная связь гидролизуется этими ферментами в одном и том же месте. На основе этих данных можно сделать вывод, что эндонуклеаза GlaI, также как PspN4I, гидролизует сайт 5'-GG(5mC)GCC-3' в середине последовательности. Таким образом, GlaI узнает и расщепляет следующую последовательность:

где стрелками показаны позиции расщепления ДНК.

Рис. 3. Расщепление олигонуклеотидных дуплексов эндонуклеазами GlaI и PspN4I. Меченные олигонуклеотиды отмечены знаком *.

Дорожки: 1 - дуплекс 3*/4 с неметилированным сайтом 5'-GCGC-3', 2 - дуплекс 3*/4, обработанный эндонуклеазой GlaI, 3 - дуплекс 1*/2 с метилированным сайтом 5'-GCGC-3', 4 - дуплекс 1*/2, обработанный эндонуклеазой GlaI, 5 - дуплекс 1*/2, обработанный экзонуклеазой III E. Coli (использована для получения маркеров длин фрагментов олигонуклеотида), 6 - дуплекс 1*/2, обработанный эндонуклеазой PspN4I (сайт узнавания 5'-GGN^NCC-3').

Детальное изучение способности GlaI расщеплять сайт узнавания с различным распределением метильных групп будет представлено в последующих публикациях.
Таким образом, в настоящей работе мы описали новую сайт-специфичную эндонуклеазу GlaI, принадлежащую к редкой группе рестриктаз, которые узнают только метилированную последовательность. Известные представители этой группы перечислены в таблице 1. Их сравнение показывает, что сайты узнавания этих трех ферментов имеют явные сходства: 1) для расщепления необходимо метилирование второго основания в сайте узнавания; 2) место расщепления находится сразу за метилированным основанием. Сайт узнавания для BisI сходен с сайтом для GlaI и отличается только на один неопределенный нуклеотид (N), расположенный в середине сайта. Следует отметить, что DpnI и GlaI расщепляют ДНК с образованием тупых концов, тогда как их аналоги, гидролизующие такие же, но неметилированные сайты в ДНК, расщепляют последнюю с образованием липких концов.

   Таблица 1. Сайты узнавания ЭР группы II M.

Рассмотренное сходство сайтов узнавания для GlaI, BisI и DpnI может отражать общее эволюционной происхождение ферментов группы II M.
Как обсуждалось ранее [2], роль ферментов, которые узнают и расщепляют только метилированную ДНК, может быть связана с защитой бактерии от заражения фагами, содержащими метилированную ДНК. Известно, что ряд бактериофагов содержит гены сайт-специфических ДНК-метилтрансфераз, что приводит к метилированию ДНК фагов [5].
GlaI может быть полезным для определения статуса метилирования эукариотической ДНК, потому что сайт узнавания GlaI содержит метилированную CG последовательность, специфичную для эукариотических геномов.

Авторы статьи выражают благодарность А.Р. Ахмедовой за помощь в выделении фермента GlaI.

Патент РФ № 2287012 C1

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lack, S., Greenberg, B. J. // Biol. Chem. - 1975. V.250 P.4060-4066.
2. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезентцева Н.В., Дедков В.С., Гончар Д.А., Абдурашитов М.М., Дегтярев С.Х. // Биотехнология. 2005 №3 C.22-26 (интернет-версия).
3. Pingoud, A., and Jeltsch A. // Nucleic Acids Res. 2001. V.29. P.3705-3727.
4. Roberts, R.J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. // Nucleic Acids Res. 1988. V.33 P.230-232.
5. Gunthert, U., Lauster, R., and Reiners, L. // Eur. J. Biochem. - 1986. - V.159. - P.485-492.