Метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза BlsI узнаёт и расщепляет последовательность ДНК 5’-RYNRY-3’ при наличии в ней не менее двух 5-метилцитозинов

 

В.А. Чернухин, Д.А. Гончар, Ю.Э. Томилова, А.А. Болтенгаген, Л.Н. Голикова, С.Х. Дегтярёв

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 9 , № 2 ,с. 30-38, 2013

 

Изучена субстратная специфичность метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы BlsI. Показано, что BlsI гидролизует вырожденную последовательность ДНК 5’-RYNRY-3’ (где R – A или G, а Y – T или C) при наличии в ней двух или более 5-метилцитозинов. Эффективность гидролиза ДНК ферментом зависит от числа 5-метилцитозинов и их положения в узнаваемой последовательности. Поскольку эндонуклеаза BlsI расщепляет только С5-метилированную ДНК, она может быть использована в молекулярно-биологических и эпигенетических исследованиях для оценки метилирования геномной ДНК эукариот.

 

Введение

5-Метилцитозин-зависимые сайт-специфические ДНК эндонуклеазы (MD-эндонуклеазы, от англ. methyl-directed) были обнаружены сравнительно недавно [1,2]. Эти ферменты узнают и специфически расщепляют определенные последовательности ДНК только при наличии в них 5-метилцитозина. По своим биохимическим свойствам MD-эндонуклеазы аналогичны хорошо изученным эндонуклеазам рестрикции типа II. Однако, если эндонуклеазы рестрикции узнают и гидролизуют немодифицированную ДНК и не расщепляют метилированную, то MD-эндонуклеазы, наоборот, гидролизуют метилированную ДНК и совершенно не расщепляют нативную немодифицированную ДНК [1-7].

Ранее нами было показано, что MD-эндонуклеаза BlsI гидролизует последовательность ДНК 5'-G(5mC)NGC-3'/3’-CGN(5mC)G-5’ [3]. В данной работе мы предприняли детальное изучение  субстратной специфичности BlsI.

 

Материалы и методы

 

Препараты ферментов и субстраты для них

Для экспериментов использовали препарат фермента BlsI c активностью 16 ед/мкл,  T4 полинуклеотидкиназу, препараты ДНК и буферные растворы производства НПО «СибЭнзим» (Россия), а также ДНК-метилтрансферазу CviPI производства «New England Biolabs» (США). Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы в НПО «СибЭнзим» (Россия). Их первичная структура приведена в таблице 1.

В качестве маркёра молекулярных весов ДНК использовали ДНК-маркёр 1 kb и pUC19/MspI («СибЭнзим», Россия).

 

N1:  5’-CCCTTTCCTCTTTTGTAG(5mC)TTTTCCC-3’

N2:  5’-GGGAAAAG(5mC)TACAAAAGAGGAAAGGG-3’

N3:  5’-CCCTTTCCTCTTTTACAG(5mC)TTTTCCC-3’

N4:  5’-GGGAAAAG(5mC)TGTAAAAGAGGAAAGGG-3’

N5:  5’-CCCTTTCCTCTTTTATAG(5mC)TTTTCCC-3’

N6:  5’-GGGAAAAG(5mC)TATAAAAGAGGAAAGGG-3’

N7:  5’-GGGAAAAG(5mC)TA(5mC)AAAAGAGGAAAGGG-3’

N8:  5’-CCCTTTCCTCTTTTA(5mC)AG(5mC)TTTTCCC-3’

N9:  5’-GGGAAAAGCTA(5mC)AAAAGAGGAAAGGG-3’

N10: 5’-GCTTGTACTTTGA(5mC)GGTATTGATTCTCACCACG-3’

N11: 5’-CGTGGTGAGAATCAATA(5mC)CGTCAAAGTACAAGC-3’

N12: 5’-CCCTTTCCTCTTTTA(5mC)AGCTTTTCCC-3’

N13: 5’-GCTTGTACTTTGA(5mC)AGTATTGATTCTCACCACG-3’

N14: 5’-CGTGGTGAGAATCAATA(5mC)TGTCAAAGTACAAGC-3’

N15: 5’-GCTTGTACTTTAGCGGCATTGATTCTCACCACG-3’

N16: 5’-CGTGGTGAGAATCAATGCCGCTAAAGTACAAGC-3’

N17: 5’-GCTTGTACTTTAG(5mC)GGCATTGATTCTCACCACG-3’

N18: 5’-CGTGGTGAGAATCAATG(5mC)CGCTAAAGTACAAGC-3’

N19: 5’-GCTTGTACTTTAGCGG(5mC)ATTGATTCTCACCACG-3’

N20: 5’-CGTGGTGAGAATCAATGCCG(5mC)TAAAGTACAAGC-3’

N21: 5’-GCTTGTACTTTAG(5mC)GG(5mC)ATTGATTCTCACCACG-3’

N22: 5’-CGTGGTGAGAATCAATG(5mC)CG(5mC)TAAAGTACAAGC-3’

N23: 5’-GCTTGTACTTTAA(5mC)GA(5mC)ATTGATTCTCACCACG-3’    

N24: 5’-CGTGGTGAGAATCAATGTCGTTAAAGTACAAGC-3’

Таблица 1. Структура олигонуклеотидов, использованных в данной работе. Нуклеотиды, входящие в состав изучаемого участка, подчеркнуты.

 

Метилирование субстратных ДНК ферментом M.CviPI

Метилирование pUC19 и других плазмидных ДНК проводили при 37°С в течение 1 часа в 20 мкл реакционной смеси содержащей ДНК в количестве 0,2 мкг, SE-буфер «Y» (33 мМ Трис-ацетат pH 7,9 (при 25°С), 66 мМ калия ацетат, 10 мМ магния ацетат, 1 мМ DTT), SAM – 100 мкм, препарат фермента M.CviPI (4 ед/мкл) – 1 мкл.

 

Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой BlsI и анализ продуктов реакции

Гидролиз плазмидной ДНК проводили при 37 °С в 20 мкл реакционной смеси содержащей SE-буфер «W» (10 мМ Трис-HCl pH 8,5 (при 25°С), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT), ДНК в количестве 0,5 мкг и 1 мкл препарата фермента BlsI (16 ед/мкл) в течение 2 часов. Для разделения продуктов гидролиза плазмидной ДНК применяли электрофорез в 1% агарозном или 15% полиакриламидном гелях в буфере ТАЕ.

 

Приготовление олигонуклеотидного дуплекса

Одну из цепей изучаемого олигонуклеотидного дуплекса модифицировали по 5’-концу с помощью Т4 полинуклеотидкиназы и γ[32P]-ATP. После очистки олигонуклеотида от побочных продуктов реакции к нему добавляли эквимолярное количество комплементарного немеченого олигонуклеотида и пробирку прогревали 5 минут при 95°С с последующим охлаждением до комнатной температуры на рабочем столе.

 

Гидролиз олигонуклеотидных дуплексов эндонуклеазой BlsI

Реакцию гидролиза проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей SE-буфер «W», олигонуклеотидный дуплекс в концентрации 40 нМ и 1 мкл препарата фермента BlsI при температуре 37°С в течение 1 часа. Электрофорез продуктов гидролиза проводили в денатурирующем 20%-ном полиакриламидном геле с 7 М мочевиной в трис-боратном буфере. Радиоавтографию геля проводили с помощью прибора Personal Molecular Imager («BioRad», США) и программы Quantity One V.4.6.7 («BioRad», США).

 

Определение степени гидролиза олигонуклеотидных дуплексов

Для определения степени расщепления на радиоавтографе электрофореграммы продуктов гидролиза олигонуклеотида определялась величина DLU (Digital Light Units), которая пропорциональна интенсивности излучения изотопом [32P], за вычетом фона. Процент гидролиза определяли как отношение DLU для полученного продукта реакции к сумме DLU, приходящихся на оставшуюся исходную ДНК и полученный фрагмент ДНК. Обработку данных осуществляли с помощью программы OptiQuant V. 0.3.00 (Packard Instrument Co., USA).

 

Результаты и обсуждение

 

Гидролиз метилированной последовательности 5’-GCNGC-3’ эндонуклеазой BlsI

Ранее нами было показано, MD-эндонуклеаза BlsI расщепляет ДНК плазмиды pFsp4HI1 [3]. Эта плазмида содержит ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI [8], модифицирующей сайты 5'-GCNGC-3' с образованием последовательностей 5'-G(5mC)NGC-3'/3’-CGN(5mC)G-5’, по которым и осуществляется гидролиз ферментом BlsI. На рисунке 1 приведена фотография агарозного геля, на котором видно, что BlsI специфически расщепляет плазмиду pFsp4HI1, образуя характерный набор фрагментов (дор. 8). При этом фермент не гидролизует такие субстраты, как, например, ДНК фага λ (dcm+) (дор. 2), фага T7 (дор. 4) и ДНК плазмиды pHspAI [2], в которой метилированы сайты 5'-GCGC-3' с образованием последовательности  5'-G(5mC)GC-3'/3’-CG(5mC)G-5’ (дор. 6).

b_320_200_16777215_00_Pics_paper80_fig1.jpg

 

 

Рис. 1. Расщепление эндонуклеазой BlsI ДНК плазмиды pFsp4HI1, содержащей метилированные последовательности 5'-GСNGC-3'. Электрофорез в 1% агарозном геле.

Дорожки: 1 – ДНК фага λ, 2 – ДНК фага λ + BlsI, 3 – ДНК фага T7, 4 – ДНК фага T7 + BlsI, 5 – ДНК pHspAI, 6 – ДНК pHspAI + BlsI, 7 – ДНК pFsp4HI1, 8 – ДНК pFsp4HI1 + BlsI, M – ДНК-маркёр 1kb.

 

 

В настоящей работе мы исследовали способность MD-эндонуклеазы BlsI расщеплять другие субстраты. Последовательность 5'-GCNGC-3'/3’-CGNCG-5’ может включать от одного до четырех метилированных цитозинов (не считая центрального основания N). Необходимо было определить активность фермента BlsI при расщеплении сайта 5'-GCNGC-3'/3’-CGNCG-5’, содержащего различное количество 5-метилцитозинов. Кроме того, как мы установили ранее, MD-эндонуклеаза GlaI расщепляет не только последовательность 5’-G(5mC)GC-3’, но и вырожденные варианты этой последовательности с общей формулой 5’-R(5mC)GY-3’ [9]. В связи с этим мы определяли способность MD-эндонуклеазы BlsI гидролизовать вырожденные варианты последовательности 5'-GCNGC-3'/3’-CGNCG-5.

 

Гидролиз ДНК, содержащей метилированные G(5mC)-динуклеотиды

Cпособность BlsI расщеплять последовательность 5'-GCNGC-3'/3’-CGNCG-5’ с различным количеством 5-метилцитозинов определялась в экспериментах на специально подобранных плазмидных ДНК.  Для получения таких субстратов мы использовали ДНК-метилтрансферазу M.CviPI, которая метилирует динуклеотид 5’-GC-3’ с образованием 5’-G(5mC)-3’/3’(5mC)G-5’ [10]. ДНК pUC19 была обработана ферментом M.CviPI как описано в разделе «Материалы и методы» и далее подвергалась гидролизу MD-эндонуклеазой BlsI. Стоит отметить, что плазмида pUC19/M.CviPI содержит метилированные цитозины не только в последовательностях 5’-GCNGC-3’/3’-CGNCG-5’, но и в последовательностях вида 5'-RYNGC-3'/3’-YRNCG-5’, которые также могут служить мишенью для BlsI.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper80_fig2.jpg

 

 

Рис. 2. Электрофореграмма ДНК-фрагментов, образованных в результате сайт-специфического гидролиза плазмиды pUC19/M.CviPI эндонуклеазой BlsI. Электрофорез в 15% ПААГ.

Дорожки: 1 – Маркер pUC19/MspI, 2 – ДНК pUC19/M.CviPI + BlsI, 3 - теоретически рассчитанные длины фрагментов ДНК, образующихся при расщеплении pUC19 по последовательностям 5’-GCNRY-3’ и 5’-RYNGC-3'.

 

 

Результаты эксперимента представлены на рисунке 2. Справа от фотографии геля на рисунке представлена полученная расчетным путем теоретическая картина расщеплении pUC19 по последовательности 5’-GCNRY-3’ и комплементарной ей последовательности 5'-RYNGC-3' с указанием длин получаемых фрагментов.

Как видно из рисунка 2, длины фрагментов ДНК, образованных при гидролизе pUC19/M.CviPI ферментом BlsI, близки к расчетным длинам, полученным при расщеплении плазмиды pUC19 по последовательностям 5’-GCNRY-3’ и 5’-RYNGC-3'. Несколько дополнительных фрагментов, видимых на электрофореграмме и имеющих меньшую интенсивность, являются, видимо, результатом неполного гидролиза плазмидной ДНК. Таким образом, помимо последовательности 5'-G(5mC)NGC- 3'/3’-CGN(5mC)G-5’ [3], BlsI способен узнавать и расщеплять последовательность 5’-G(5mC)NRY-3'/3’-(5mC)GNYR-5’.

 

Гидролиз ДНК, содержащей A(5mC) динуклеотиды в сайте 5'-RYNRY-3'

Для проверки способности фермента BlsI расщеплять полностью вырожденный сайт 5'-RYNRY-3' с 5-метилцитозинами, но без G(5mC)-динуклеотидов, мы использовали плазмиду pFat/Kz3(GTNAC), содержащую последовательности 5'-GTNA(5mC)-3'/3'-(5mC)ANTG-5'. Исходная плазмида pFat/Kz3 была получена путем клонирования Kzo9I-фрагмента геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium aquatile NL3, содержащего ген ДНК-метилтрансферазы M.FatI, в вектор pUC19 по сайту эндонуклеазы рестрикции BamHI. ДНК-метилтрансфераза M.FatI метилирует цитозин в сайте 5’-CATG-3’ с образованием последовательности 5’-(5mC)ATG-3’. Плазмида pFat/Kz3(GTNAC) была полученна путем встраивания в плазмиду pFat/Kz3 по сайту эндонуклеазы рестрикции HindIII олигонуклеотидного дуплекса:

5'-agctcatgtcacatg-3'
3'-gtacagtgtactcga-5'

Ввиду наличия в олигонуклеотидном дуплексе двух сайтов метилирования 5’-CATG-3’, в плазмиде pFat/Kz3(GTNAC) возникает уникальная последовательность 5’-(5mC)ATGTCA(5mC)ATG-3’/3’-GTA(5mC)AGTGTA(5mC)-5’, содержащая изучаемый сайт 5'-GTNA(5mC)-3'/3'-(5mC)ANTG-5' (подчеркнут).

b_320_200_16777215_00_Pics_paper80_fig3.jpg

 

 

Рис. 3. Гидролиз плазмид pFat/Kz3 и pFat/Kz3(GTNAC) ДНК-эндонуклеазой BlsI.

Дорожки: 1 – ДНК pFat/Kz3 + DriI, 2 – ДНК pFat/Kz3 + DriI + BlsI, 3 – ДНК pFat/Kz3(GTNAC) + DriI, 4 – ДНК pFat/Kz3(GTNAC) + DriI + BlsI, M – ДНК-маркёр 1kb.

 

 

 

На рис.3 приведена картина расщепления эндонуклеазой BlsI плазмид pFat/Kz3 и pFat/Kz3(GTNAC), предварительно линеаризованных рестриктазой DriI. Как видно из этого рисунка, pFat/Kz3(GTNAC) расщепляется эндонуклеазой BlsI в единственном месте, в то время как гидролиз плазмиды pFat/Kz3 не происходит. Электрофоретическая подвижность продуктов гидролиза соответствует теоретически рассчитанным длинам фрагментов (3660 и 1260 п.н.), которые должны образоваться при расщеплении метилированной последовательности 5'-GTNA(5mC)-3'/3'-(5mC)ANTG-5'.

Таким образом, BlsI гидролизует последовательность 5'-GTNA(5mC)-3'/3'-(5mC)ANTG-5' в плазмиде pFat/Kz3(GTNAC). Выявленная нами способность MD- эндонуклеазы BlsI расщеплять метилированный сайт, не содержащий в своем составе GC-динуклеотидов, ставит вопрос о возможности расщепления других сайтов, содержащих 5-метилцитозин в последовательности 5'-RYNRY-3'.

 

Гидролиз олигонуклеотидов с различными вариантами метилированной последовательности 5’-RYNRY-3’

Для подтверждения возможности расщепления эндонуклеазой BlsI различных вариантов метилированной последовательности 5'-RYNRY-3', мы использовали синтетические олигонуклеотидные дуплексы, содержащие два и более 5-метилцитозина в последовательности 5'-RYNRY-3'. Результаты экспериментов приведены на рисунках 4-8.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper80_fig4.jpg

Рис. 4. Расщепление эндонуклеазой BlsI дуплексов, содержащих сайт 5’-GCNGC-3’ с различным количеством и расположением 5-метилцитозинов.

Дорожки: 1,2 – дуплекс N17*/N18 (последовательность 5’-G(5mC)GGC-3’/3’-CGC(5mC)G-5’); 3,4 – дуплекс N17*/N20 (5’-G(5mC)GGC-3’/3’-(5mC)GCCG-5’);
5,6 - дуплекс N17*/N22 (5’-G(5mC)GGC-3’/3’-(5mC)GC(5mC)G-5’); 7,8 - дуплекс N19*/N20 (5’-GCGG(5mC)-3’/3’-(5mC)GCCG-5’);
9,10 - дуплекс N19*/N22 (5’-GCGG(5mC)-3’/3’-(5mC)GC(5mC)G-5’); 11,12 - дуплекс N21*/N18 (5’-G(5mC)GG(5mC)-3’/3’-CGC(5mC)G-5’);
13,14 - дуплекс N21*/N20 (5’-G(5mC)GG(5mC)-3’/3’-(5mC)GCCG-5’); 15,16 - дуплекс N21*/N22 (5’-G(5mC)GG(5mC)-3’/3’-(5mC)GC(5mC)G-5’).
Нечётные номера – интактный дуплекс, чётные номера – дуплекс, обработанный BlsI. Значком * выделена меченая олигонуклеотидная цепь. Электрофорез в 20%-ном полиакриламидном геле с 7 М мочевиной.

На рисунке 4 представлена электрофореграмма продуктов гидролиза эндонуклеазой BlsI олигонуклеотидов с различным количеством 5-метилцитозинов в сайте узнавания 5'-GCNGC-3'. Как видно из этого рисунка BlsI эффективно расщепляет последовательность GCNGC при наличии в ней двух (дорожки 2,4,8), трёх (дорожки 6,10,12,14) или четырёх (дорожка 16) 5-метилцитозинов. Таким образом, MD-эндонуклеаза BlsI способна расщеплять узнаваемую последовательность при наличии в ней двух или более 5-метилцитозинов, расположенных в любых возможных комбинациях в последовательности 5'-GCNGC-3'.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper80_fig5.jpg

Рис. 5. Расщепление эндонуклеазой BlsI дуплексов, содержащих сайт 5’-ACNGC-3’/3’-TGNCG-5’) с различными вариантами расположения метилированных цитозинов.

Дорожки: 1,2 – дуплекс N3*/N4 (5’-ACAG(5mC)-3’/3’-TGT(5mC)G-5’); 3,4 – дуплекс N4*/N3 (5’- G(5mC)TGT-3’/3’-(5mC)GACA-5’);
5,6 - дуплекс N4*/N8 (5’- G(5mC)TGT-3’/3’-(5mC)GA(5mC)A-5’); 7,8 - дуплекс N4*/N12 (5’- G(5mC)TGT-3’/3’-CGA(5mC)A-5’);
9,10 - дуплекс N8*/N4 (5’-A(5mC)AG(5mC)-3’/3’-TGT(5mC)G-5’); 11,12 - дуплекс N12*/N4 (5’-A(5mC)AGC-3’/3’-TGT(5mC)G-5’).
Нечётные номера – интактный дуплекс, чётные номера – дуплекс, обработанный BlsI. Значком * выделена меченая олигонуклеотидная цепь. Электрофорез в 20%-ном полиакриламидном геле с 7 М мочевиной.

На рис. 5 приведена электрофореграмма продуктов гидролиза эндонуклеазой BlsI олигонуклеотидных дуплексов, содержащих сайт узнавания 5'-ACNGC-3'/3'-TGNCG-5' с двумя и тремя метильными группами. Как видно из этого рисунка, BlsI эффективно расщепляет обе цепи этой последовательности, если в ней есть два (дорожки 2,4,8 и 12) или три (дорожки 6,10) 5-метилцитозина.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper80_fig6.jpg

Рис. 6. Расщепление эндонуклеазой BlsI дуплексов, содержащих сайт 5'-GTNGC-3'/3'-CANCG-5’ с различными вариантами расположения метилированных цитозинов.

Дорожки: 1,2 – дуплекс N1*/N2 (5’-GTAG(5mC)-3’/3’-CAT(5mC)G-5’); 3,4 – дуплекс N1*/N7 (5’-GTAG(5mC)-3’/3’-(5mC)AT(5mC)G-5’); 5,6 - дуплекс N1*/N9 (5’-GTAG(5mC)-3’/3’-(5mC)ATCG-5’);
7,8 - дуплекс N2*/N1 (5’-G(5mC)TAC-3’/3’-(5mC)GATG-5’); 9,10 - дуплекс N7*/N1 (5’-G(5mC)TA(5mC)-3’/3’-(5mC)GATG-5’);
11,12 - дуплекс N9*/N1(5’-GCTA(5mC)-3’/3’-(5mC)GATG-5’). Нечётные номера – интактный дуплекс, чётные номера – дуплекс, обработанный BlsI. Значком * выделена меченая олигонуклеотидная цепь. Электрофорез в 20%-ном полиакриламидном геле с 7 М мочевиной.

На рис.6 приведена электрофореграмма продуктов гидролиза эндонуклеазой BlsI олигонуклеотидных дуплексов, содержащих последовательность 5'-GTNGC-3'/3’-CANCG-5’ с двумя и тремя 5-метилцитозинами. Как видно из этого рисунка, BlsI эффективно расщепляет обе цепи этой последовательности при наличии в ней двух (дорожки 2,6,8,12) и трёх (дорожки 4,10) 5-метилцитозинов.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper80_fig7.jpg

Рис. 7. Расщепление эндонуклеазой BlsI олигонуклеотидных дуплексов, содержащих сайты 5’-ATNGC-3’ и 5’-ACNGT-3’.

Дорожки: 1,2 – дуплекс N5*/N6 (5’-ATAG(5mC)-3’/3’-TAT(5mC)G-5’); 3,4 – дуплекс N6*/N5 (5’-G(5mC)TAT-3’/3’-(5mC)GATA-5’);
5,6 - дуплекс N10*/N11 (5’-A(5mC)GGT-3’/3’-TGC(5mC)A-5’); 7,8 - дуплекс N13*/N14 (5’-A(5mC)AGT-3’/3’-TGT(5mC)A-5’); 9,10 - дуплекс N17*/N18 (5’-G(5mC)GGC-3’/3’-CGC(5mC)G-5’);
Нечётные номера – интактный дуплекс, чётные номера – дуплекс, обработанный BlsI. Значком * выделена меченая олигонуклеотидная цепь. Электрофорез в 20%-ном полиакриламидном геле с 7 М мочевиной.

На рисунке 7 приведены результаты гидролиза ферментом BlsI дуплекcов содержащих сайты 5’-ATNGC-3’ (дорожки 2,4) и 5’-ACNGT-3’ (дорожки 6,8). В качестве положительного контроля на данном рисунке приведён пример полного расщепления дуплекса с последовательностью 5’-G(5mC)GGC-3’/3’-CGC(5mC)G-5’ (дорожка 10).

Как видно из этого рисунка, последовательность 5’-ATAG(5mC)-3’/3’-TAT(5mC)G-5’эффективно расщепляется эндонуклеазой BlsI по обеим цепям ДНК.

В случае же последовательности 5’-ACNGT-3’ эффективность гидролиза существенно ниже, причём в случае, когда центральным нуклеотидом N сайта узнавания  является  комплементарная пара G-C, глубина гидролиза дуплекса наименьшая, не более 1,5%  (дорожка 6). Тогда как в случае, если центральный нуклеотид представлен комплементарной парой A-T, эффективность гидролиза BlsI составляет около 10% (дорожка 8).

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper80_fig8.jpg

Рис. 8. Гидролиз BlsI олигонуклеотидных дуплексов, содержащих 5-метилцитозин только в одной из цепей последовательности узнавания.

Дорожки: 1,2 – дуплекс N21*/N18 (5’-G(5mC)GG(5mC)-3’/3’-CGC(5mC)G-5’); 3,4 – дуплекс N18*/N21 (5’-G(5mC)GGC-3’/3’-(5mC)GC(5mC)G-5’);
5,6 - дуплекс N21*/N16 (5’-G(5mC)GG(5mC)-3’/3’-CGCCG-5’); 7,8 - дуплекс N16*/N21 (5’-GCGGC-3’/3’-(5mC)GC(5mC)G-5’);
9,10 – дуплекс N23*/N24 (5’-A(5mC)GA(5mC)-3’/3’-TGCTG-5’) 11,12 – дуплекс N24*/N23 (5’-GTCGT-3’/3’-(5mC)AG(5mC)A-5’)
13,14 – дуплекс N17/N16 (5’-G(5mC)GGC-3’/3’-CGCCG-5’).
Нечётные номера – интактный дуплекс, чётные номера – дуплекс, обработанный BlsI. Значком * выделена меченая олигонуклеотидная цепь. Электрофорез в 20%-ном полиакриламидном геле с 7 М мочевиной.

На рисунке 8 представлены данные по гидролизу BlsI олигонуклеотидных дуплексов, в которых 5-метилцитозин расположен только в одной из цепей узнаваемой последовательности. В качестве контроля активности фермента мы использовали дуплекс N21/N18 с метилированной последовательностью 5’-G(5mC)NG(5mC)-3’/3’-CGN(5mC)G-5’(дорожки 1,2).  

Как видно из рисунка, BlsI способен эффективно расщеплять последовательность 5’-G(5mC)GG(5mC)-3’/3’-CGCCG-5’, если на одной из цепей узнаваемой последовательности присутствует два 5-метилцитозина (дорожки 6,8). Однако, если такая последовательность содержит только один 5-метилцитозин, то не наблюдается сколь либо значительного гидролиза олигонуклеотидного дуплекса (дорожка 14).

 На рис. 8 также продемонстрированы данные по расщеплению BlsI олигонуклеотидного дуплекса, содержащего последовательность 5’-A(5mC)GA(5mC)-3’/3’-TGCTG-5’. Как следует из рисунка, BlsI расщепляет обе цепи такого дуплекса (дорожки 10, 12), однако с меньшей эффективностью по сравнению с контролем (дорожки 2,4).

 Таким образом, на основе данных, полученных в представленной работе, можно сделать вывод, что BlsI расщепляет обе цепи последовательности узнавания 5'-RYNRY-3' при наличии в ней хотя бы двух 5-метилцитозинов. При этом активность фермента зависит от количества и расположения модифицированных цитозинов в сайте узнавания. Наихудшим субстратом MD-эндонуклеазы  BlsI является последовательность 5'-A(5mC)NGT-3’/3’-TGN(5mC)A-5’. 

 

Литература

  1. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis T30 узнает метилированную последовательность ДНК 5'-G(m5C)^NGC-3'. // Биотехнология. – 2005. – №3. – С.22-26.
  2. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5'-G(5mC)^GC-3'. // Биотехнология. – 2006. – №4. – С.31-35.
  3. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательность ДНК 5’-G(5mC)N^GC-3’ и расщепляет ее с образованием 3’-выступающих концов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2007. – Т. 3. – №1. – С. 28-33.
  4. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)^NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN^(5mC)G-5’. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. – 2007. – Т.3. – №2. – С.13-17.
  5. Чернухин В.А., Журавлева Р.О., Тарасова Г.В., Болтенгаген А.А., Акишев А.Г., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Kocuria rosea - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы KroI. // Патент на изобретение RU 2394099 С1. – 2010.
  6. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Тарасова Г.В., Голикова Л.Н., Акишев А.Г., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pcs I. // Патент на изобретение RU 2377294 С1. –  2009.
  7. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н, Гончар Д.А., Томилова Ю.Э., Тарасова М.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярёв С.Х. Новая сайт-специфическая метилзависимая ДНК эндонуклеаза PkrI узнаёт и расщепляет метилированную последовательность 5`-GCN^GC-3`/3`-CG^NCG-5`, содержащую не менее 3-х 5-метилцитозинов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т.7. – № 3. – С.35-42.
  8. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Охапкина С.С., Гончар Д.А., Дедков В.С., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. // Молекулярная биология. – 2007. – Т.41. – №1. – С.43-50.
  9. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.Kh. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI. // BMC Molecular Biology. – 2008. – 9:7.
  10. Rebase official site http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html.

 

Список сокращений: R - нуклеотид с пуриновым основанием (A или G), Y – нуклеотид с пиримидиновым основанием (C или T), п.н. – пары нуклеотидов, 5mC – 5-метилцитозин, SAM – S-аденозил-L-метионин.