Новая сайт-специфическая эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнает и расщепляет последовательность ДНК 5’-G^GNNCC-3’

 

В.А. Чернухин, Н.А. Михненкова, Е.Н. Ломаковская, Н.М. Шинкаренко, В.С. Дедков, С.Х. Дегтярёв

 

 

Из бактериального штамм Bacillus pumilus N4 выделена новая эндонуклеаза рестрикции BpuN4I, определена ее субстратная специфичность и место расщепления ДНК. Эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнает последовательность ДНК 5’-G↓GNNCC-3’ и расщепляет ее как указано стрелкой. Фермент, расщепляющий сайт 5’-GGNNCC-3’ с образованием четырехнуклеотидных 5'-липких концов, обнаружен впервые. Рестриктаза BpuN4I является неошизомером фермента NlaIV, имеющего такую же последовательность узнавания, но образующего фрагменты ДНК с тупыми концами.

 

Введение

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) являются сайт-специфическими ДНК-эндонуклеазами бактерий и, как правило, входят в состав систем рестрикции-модификации. К настоящему времени известно более 3900 систем рестрикции-модификации, узнающих около 330 различных последовательностей ДНК. (http://rebase.neb.com) [1]. Некоторые рестриктазы имеют одинаковый сайт узнавания, однако расщепляют ДНК в различных позициях и называются неошизомерами.

В данной статье описывается новая рестриктаза BpuN4I, являющаяся неошизомером эндонуклеазы рестрикции NlaIV.

 

Материалы и методы

Выращивание штамма-продуцента. Биомассу B. pumilus N4 выращивали в бульоне, содержащем 1% триптон (“Organotechnie”, Франция), 0,5% дрожжевой экстракт (“Organotechnie”, Франция), 0,5% NaCl, 0,05% MgCl2 и 0,001% тиамин, рН 7,0. Для засева использовали культуру, выращенную при 30°С в течение 18 ч при встряхивании в 6-и колбах объёмом 500 мл, содержащих по 300 мл бульона.  Выращивание проводили в 20 литрах в ферментёре (“New Brunswick”, США) при 30°С, аэрации 15 л/мин, перемешивании 200 об/мин в течение 5 ч до плотности А550 = 3,4. Клетки осаждали на центрифуге J2-21 («Beckman», США) в течение 30 минут в роторе JA-10 при 8000 об/мин и замораживали. Было получено 74 г замороженных клеток.

Выделение и очистка фермента. Выделение фермента проводили при 4°С путём колоночной хроматографии. 10 г замороженной биомассы суспендировали в 40 мл буфера А (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол), содержащем 0,05 М NaCl, 0,3 мг/мл лизоцим, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PSMF), и инкубировали в течение 3 ч при постоянном перемешивании. Далее клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали в течение 30 мин в роторе JA-20 при 15000 об/мин. Супернатант пропускали через колонку с фосфоцеллюлозой P-11 ("Whatman", Англия) объёмом 30 мл, предварительно уравновешенную буфером А, содержащем 0,1 М NaCl, затем белок элюировали линейным градиентом NaCl (0,1 М - 0,65 М) в буфере А объёмом 500 мл, собирая фракции по 10 мл. Активные фракции объединяли и наносили на колонку с гидроксилапатитом объёмом 2 мл, предварительно уравновешенную буфером В (0,01 М K2HPO4, pH 7,2, 7 мМ β-меркаптоэтанол). Колонку промывали 10 мл буфера В и проводили элюцию линейным градиентом K2HPO4 (0,01 – 0,2 М), в буфере B объёмом 150 мл, собирая фракции объёмом по 2 мл. Активные фракции объединяли и наносили на колонку с гепарин-сефарозой объёмом 4 мл. Элюцию проводили линейным градиентом NaCl (0,1 М – 0,7 М) в буфере А, объёмом 120 мл, собирая фракции по 3 мл. Активные фракции объединяли и диализовали против 20 объёмов концентрирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,05 М NaCl, 50% глицерин). Препарат хранили при -20°С.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) в 100 мкл смеси, содержащей 100 нг бактериальной ДНК; однократный буфер («СибЭнзим», Россия) для Taq ДНК полимеразы (60 мМ трис-HCl (pH 8.5); 25 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl2, 10мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 % Тритон Х-100); 50 мкМ (каждый) дезоксинуклеозидтрифосфат; 0,1 мкМ (каждый) праймер и 1 ед.акт. Taq ДНК полимеразы. Профиль термоциклирования состоял из денатурации при 94 ºС в течение 3 мин с последующим добавлением фермента во время паузы при 80 ºС и проведением 30 циклов: 94 ºС – 15 с, 45 ºС – 20 с, 72 ºС – 90 с. Завершающая стадия - 72ºС – 120 с. Полученный фрагмент ДНК выделяли электрофорезом в 1%-ной агарозе и очищали при помощи набора QIAEX II (“QIAGEN GmbH”, Германия).

ПЦР фрагмента гена 16S РНК проводили с помощью следующих праймеров:

 

16S-direct        5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3'

16S-reverse      5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'

 

Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили на приборе 310 Genetic Analyzer ABI PRISMTM (“Applied Biosystems”, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Препараты ферментов, ДНК, дезоксинуклеозидтрифосфатов и  синтетических олигонуклеотидов, использованные в работе, произведены в НПО "СибЭнзим" (г. Новосибирск).

 

Результаты и обсуждение

Идентификация штамма. Штамм-продуцент нового фермента выделен нами из почвенных изолятов, как описано ранее [2, 3] и депонирован в Коллекции культур микроорганизмов НПО «СибЭнзим» под номером 8М06. Клетки - подвижные грамположительные палочки размером 0,7 х (2-5) мкм. Образуют овальные эндоспоры, не раздувающие клетку, расположенные центрально. Клетки аэробные, каталазоположительные,  растут при температуре от 10°С до 45°С.  На питательном агаре при 30°С за ночь образуют колонии, которые немного выпуклые, матово-блестящие, полупрозрачные, сероватые, до 4 мм в диаметре, нередко расползаются.  При старении  колонии белеют и становятся непрозрачными. Образуют кислоту и ацетоин из глюкозы, но не газ. Не гидролизуют крахмал, не восстанавливают нитрат в нитрит. Содержание G+C в ДНК штамма, определенное по методу [4], составляет 40%.

Определение первичной структуры гена 16S рРНК. Полимеразную цепную реакцию с праймеров 16S-direct и 16S-reverse на ДНК бактерии с последующим выделением полученного фрагмента ДНК и определением его первичной структуры проводили, как описано в методах. В соответствии с классификатором (http://rdp.cme.msu.edu) данная последовательность 16S РНК соответствует бактерии  рода Bacillus. Идентификация по определителю Берги [5] также позволяет отнести изучаемый штамм к виду Bacillus pumilus. Таким образом, на основе полученных морфологических данных и структуре гена16S РНК штамм 8М06 был определен нами как Bacillus pumilus N4, а продуцируемая им рестриктаза в соответствии с номенклатурой [6] названа BpuN4I.

Определение оптимальных условий действия фермента. Оптимальные условия активности рестриктазы определяли путем расщепления λ ДНК (50 мкг/мл) при 37°С, 55 °С и 70°С в 5-и стандартных SE буферных растворах: буфер В - 10 мМ трис-HCl (рН 7,6 при 25 °С), 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ; буфер G - 10 мМ трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер O - 50 мМ трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер W - 10 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 mM MgCl2, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер Y - 33 мМ трис-ацетат (рН 7,9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия и 1 мМ ДТТ.  За единицу активности BpuN4I  принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага λ в буфере Y за 1 ч при 37°С в 20 мкл инкубационной смеси.

Все дальнейшие реакции с рестриктазой BpuN4I проводили в оптимальных условиях в течение 1 часа.

Определение сайт-специфичности BpuN4I. Cайт, узнаваемый рестриктазой, определяли по картинам расщепления различных ДНК. На рис. 1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК фагов λ и Т7эндонуклеазами рестрикции BpuN4I и PspN4I, причём последняя имеет узнаваемую последовательность 5’-GGNNCC-3’ (www.sibenzyme.com). Поскольку фрагменты ДНК были идентичны, это значит, что PspN4I и BpuN4I узнают и расщепляют одну и ту же последовательность ДНК. Таким образом, эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнаёт и расщепляет разнесённую тетрануклеотидную последовательность 5’-GGNNCC-3’.

 

 . Гидролиз ДНК фагов лямбда и Т7 эндонуклеазами рестрикции PspN4I и BpuN4I

 

 

Рис. 1. Гидролиз ДНК фагов лямбда и Т7 эндонуклеазами рестрикции PspN4I и BpuN4I. Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки:1 - ДНК фага λ; 2 - ДНК фага λ + PspN4I; 3 - ДНК фага λ + BpuN4I; 4 - ДНК фага Т7; 5 - ДНК фага Т7+ PspN4I; 6 - ДНК фага Т7+ BpuN4I; 7 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим).

 

 

 

Определение позиции гидролиза ДНК рестриктазой BpuN4I. Для подтверждения правильности установленной последовательности узнавания BpuN4I и определения позиции расщепления ДНК мы проводили гидролиз синтетического олигонуклеотидного дуплекса образованного из комплементарных олигонуклеотидов KpnI-1 и KpnI-2. Узнаваемая BpuN4I последовательность выделена рамочкой.

 b_320_200_16777215_00_Pics_paper81-fig3.gif

 

 

Определение места гидролиза ДНК BpuN4I осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазой рестрикции BpuN4I с позициями гидролиза эндонуклеазы PspN4I (расщепляющей сайт узнавания 5’-GGNNCC-3’ межу центральными нуклеотидами N) и Acc65I (расщепляющей сайт узнавания 5’-GGTACC-3’после первого гуанина). В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ExoIII из E.coli. На рис. 2 приведен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления радиоактивно меченого дуплекса KpnI-1*/KpnI-2 в 20% ПААГ, с 7М мочевиной. Как видно из рис. 2, фрагменты ДНК, образованные гидролизом BpuN4I и Acc65I соответствующих дуплексов имеют одинаковую длину, что говорит об идентичности позиций гидролиза узнаваемой последовательности у этих ферментов на данном дуплексе. В то же время длина меченого P32 фрагмента, образованного гидролизом PspN4I на два нуклеотида длиннее. Таким образом, BpuN4I узнаёт последовательность ДНК 5’-GGNNCC-3’ и расщепляет её после первого гуанина на обеих цепях ДНК, образуя 5’-выступающие тетрануклеотидные концы. Данный фермент является неошизомером NlaIV.

 

Определение места расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции BpuN4I

 

 

Рис. 2. Определение места расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции BpuN4I. Меченные олигонуклеотиды отмечены знаком *. Дорожки: 1 – дуплекс KpnI-1*/KpnI-2; 2 – дуплекс KpnI-1*/KpnI-2 + PspN4I; 3 – дуплекс KpnI-1*/KpnI-2 + BpuN4I; 4 – дуплекс KpnI-1*/KpnI-2 + ExoIII; 5 – дуплекс KpnI-1*/KpnI-2  + Acc65I.

 

 

 

 

Заключение

При гидролизе узнаваемой последовательности рестриктазой BpuN4I образуются 5’-выступающие “липкие” концы, сходные с концами, образованными в результате гидролиза ДНК  ферментами c гексануклеотидным сайтом узнавания, расщепляющими некоторые варианты последовательности 5’-GGNNCC-3’: Acc65I (сайт узнавания 5’-G^GTACC-3’), HgiC1I (сайт узнвания 5’-G^GYRCC-3’), BamHI (5’-G^GATCC-3’), PspOMI (5’-G^GGCCC-3’). Сайты узнавания перечисленных выше рестриктаз входят в состав полилинкерных последовательностей наиболее распространённых векторов для клонирования ДНК. Учитывая этот факт, а также сходные липкие концы, образующиеся при гидролизе данными ферментами, можно предположить, что описанный новый фермент BpuN4I окажется полезным для генно-инженерных манипуляций.

 

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации по государственному контракту, заключенному в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы».

 

Литература

  1. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. 2010. REBASE - a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236.
  2. Дедков В.С., Погребняк В.Б. Определение эдонуклеаз рестрикции в лизатах из отдельных колоний бактерий и измерение активности BamHI, PstI и MspI у бактерий, выращенных на питательном агаре и в бульоне //  Внехромосомные генетические элементы: значение для науки и практики: 6-е рабочего совещание по программе «Плазмида». Тезисы докладов. – М., 1981. – С. 50 – 51.
  3. Дедков В. С., Дегтярев С.Х. Определение эндонуклеаз рестрикции в колониях микроорганизмов Streptomyces и Nocardia. // Прикл. биохимия и микробиология. – 1992. - Т. 28. – С. 309—313.
  4. Дедков В.С. Определение содержания G+C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции. // Биотехнология. - 2004. - № 4. - С.77 - 82.
  5. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж. Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. - М., 1997.
  6. Smith, H.O., Nathans, D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol. 81. - P. 419 - 423.

 

Список  сокращений

ДТТ — дитиотреитол; рестриктаза – эндонуклеаза рестрикции, сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза; Трис – трис (оксиметил) аминометан; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; BSA-Ac – бычий сывороточный альбумин ацетилированный; N —  нуклеотид, содержащий аденин или цитозин или гуанин или тимин.