Эндонуклеаза рестрикции AjnI из Acinetobacter johnsonii R2 — изошизомер EcoRII, узнаёт 5’-^CCWGG-3’, но не блокируется dcm-метилированием

Категория: Новые ферменты

Просмотров: 5109

Из природных изолятов был выделен новый продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), идентифицированный как вид Acinetobacter johnsonii R2, а его рестриктаза названа AjnI. Описан способ очистки и оценки активности фермента. Показано, что рестриктаза AjnI образует фрагменты ДНК с 5’-CCWGG выступающими концами, как и EcoRII, но не блокируется dcm-метилированием. Рестриктаза AjnI может найти широкое применение в генетической инженерии.

ВВЕДЕНИЕ

Ферменты рестрикции - модификации EcoRII открыты и изучены в числе первых RM-систем [1, 2]. Эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза) EcoRII расщепляет ДНК по сайту 5'-↓CCWGG-3' (W - A или T), образуя 5'-выступающие концы из 5-и нуклеотидов [3]. ДНК метилтрансфераза M.EcoRII защищает хозяйскую ДНК от своей рестриктазы, модифицируя внутренний цитозин в последовательности 5'-C(5mC)WGG-3' на обеих цепях ДНК [1, 4]. Многие лабораторные штаммы E. coli имеют dcm-метилтрансферазу [5, 6], которая модифицирует ДНК идентично M.EcoRII. Плазмиды, выделенные из таких штаммов, устойчивы к действию рестриктазы EcoRII и её изошизомеров, что ограничивает применение этих ферментов в генетической инженерии. Неошизомеры рестриктазы EcoRII, подобные ApyI [7], MvaI [8, 9] и BstNI [10, 11], не блокируются dcm-метилированием, но расщепляют ту же последовательность ДНК иначе, по сайту 5'-CC↓WGG-3'. Такие изошизомеры во многих случаях могут заменить прототип, однако, не во всех. В генетической инженерии, например при получении геномных библиотек, удобно линеаризовать вектор крупнощепящей рестриктазой, а донорную ДНК фрагментировать мелкощепящим ферментом, образующим комплементарные концы ДНК. Не смотря на большое число прототипов, подобрать такую пару ферментов не просто, особенно если желательны выступающие 5'-концы. Такую пару могут составить рестриктазы SexAI (узнаёт 5-A↓CCWGGT-3') и EcoRII (узнаёт 5-↓CCWGG-3'). К сожалению, оба фермента чувствительны к dcm-метилированию. Недавно обнаруженный нами фермент MabI - изошизомер рестриктазы SexAI, не блокируется dcm-метилированием, но подобных изошизомеров рестриктазы EcoRII ранее обнаружено не было.
Целью данной работы было получение и изучение некоторых свойств новой рестриктазы AjnI из бактерии Acinetobacter johnsonii R2, которая является изошизомером EcoRII и не чувствительна к dcm-метилированию.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Штамм A. johnsonii R2 выделен нами из пресной воды при поиске рестриктаз по методике [12, 13]. Морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [14]. Определение микроорганизма до вида проводили по определителю [15].
A. johnsonii R2 выращивали до насыщения в 24-х качалочных колбах объёмом по 700 мл, содержащих по 300 мл среды, содержащей: 1% триптона (Organotechnie, Франция), 0.5% дрожжевого экстракта (той же фирмы), 0.5% NaCl, 0.05% MgCl₂, 0.001% тиамина, рН 7.5 в инкубаторе G-25 (New Brunswick, США) при 28°C со встряхиванием 170 об/мин в течение 20 ч. Клетки (33 г) осаждали центрифугированием при 8000 об/мин и замораживали.
Для определения стадии роста культуры оптимальной для выделения рестриктазы измеряли в пробах оптическую плотность при 550 нм в 1 см (ОП₅₅₀). Клетки из 1 мл осаждали и замораживали. Осадки суспензировали до 10 ОП₅₅₀ в буфере, содержащем 0.02% лизоцим (Serva, Германия), 0.1% тритон Х-100 в ТЕ-буфере: 10 мМ трис-HCl (рН 7.7) и 1 мМ ЭДТА. Лизис проводили 0.5 ч при 22°C. 100 мкл лизата дополняли буфером Y (см. далее) и 60 мкл отбирали в ячейку, содержащую 6 мкл λ ДНК (500 мкг/мл в ТЕ-буфере). Делали 5 последовательных 2-кратных разведений в пробах по 30 мкл смеси, содержащей 50 мкг/мл λ ДНК в буфере Y. Пробы инкубировали 2 ч при 55°C и анализировали мини-электрофорезом в 1% агарозе в трис-ацетатном буфере с этидийбромидом (0.5 мг/л) при напряжении 5В/см за 70 мин по методике [16]. Маркёром длин ДНК служила λ ДНК, фрагментированная BssT1I. За единицу активности AjnI принимали полное специфическое расщепление ферментом 1 мкг ДНК фага λ за 1 ч в этих условиях, а за единицу активности нуклеаз - гидролиз ДНК до 100 н.п. Обе активности относили к единице ОП₅₅₀ в 1 мл.
Выделение рестриктазы AjnI проводили при 4°С. Все растворы содержали 10 мМ К фосфатный буфер (рН 7.2), 7 мМ β-меркаптоэтанол и 0.1 мМ ЭДТА. 20 г клеток суспензировали в 60 мл 0.2 М NaCl с 0.03% лизоцимом и инкубировали 16 ч. Клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали при 15000 об/мин 40 мин. Экстракт разбавляли 2-мя объёмами буфера и пропускали через колонку с фосфоцеллюлозой Р11 (Whatman, Англия) объёмом 40 мл. Нуклеазы не задерживались. Колонку промывали 0.05 М NaCl, затем градиентом NaCl от 0.05 до 0.6 М (объёмом 400 мл). Элюат собирали в 50 пробирок. Фракции 17-23, содержащие фермент, объединяли и наносили на колонку с 5 мл гидроксилапатита и промывали 0.2 M NaCl. Фермент смывали в градиенте К фосфатного буфера в концентрации от 0.01 до 0.25 М объёмом 120 мл в 50 пробирок. Фракции 18-23 диализовали 1 ч против 1 мМ K₂HPO₄, наносили на колонку с 4 мл гепарин-сефарозы (Sigma, США) и промывали её 0.05 М NaCl. Фермент смывали в градиенте NaCl от 0.05 до 0.6 М объёмом 100 мл в 50 пробирок. Фракции 18-24 диализовали против буфера с 50%-ным глицерином и хранили при -20°C.
Оптимальные условия активности рестриктазы определяли путём расщепления ДНК фага λ (50 мкг/мл в 50 мкл) при 37 и 55°C в 5 стандартных буферных растворах: буфер В - 10 мМ трис-HCl (pH 7.6 при 25°С), 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ ДТТ; буфер G - 10 мМ трис-HCl (pH 7.6), 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер O - 50 мМ трис-HCl (pH 7.6), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер W - 10 мМ трис-HCl (pH 8.5), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер Y - 33 мМ трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия и 1 мМ ДТТ. Инкубацию проб проводили 1 ч и анализировали электрофорезом. Затем в оптимальном буфере активность определяли при 30, 40, 50, 60 и 70°C.
Для определения места расщепления ДНК рестриктазой использовали синтетический дуплекс с последовательностью, узнаваемой AjnI. Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы по методике [17]. По методикам [16] каждую цепь метили по 5'-концу при помощи Т4 полинуклеотидкиназы и γ-³²P-АТФ и гибридизовали с немеченой комплементарной цепью. Полученные таким образом меченые модификации дуплекса расщепляли рестриктазами AjnI, а также Psp6I и Bst2UI. Фрагменты разделяли электрофорезом в 20%-ном ПААГ с 7 М мочевиной. Гель сканировали на приборе "Cyclone"(Packard, США). Для контроля разделения фрагментов по нуклеотидам дуплекс обрабатывали экзонуклеазой III из E.coli.
Препараты ферментов: рестриктаз Bst2UI и Psp6I, экзонуклеазы III из E.coli и Т4 полинуклеотидкиназы; а также препараты ДНК: фага λ, плазмиды PBR322 и маркёра λ/BssT1I, использованные в работе, произведены в НПО "СибЭнзим".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Бактериальный штамм продуцент рестриктазы AjnI имеет следующие характеристики. Клетки неподвижные короткие палочки размером 1.3х2 мкм; располагаются одиночно, попарно, а также цепочками; спор не образуют. По Граму окрашиваются отрицательно и выглядят как кокки располагающиеся парами. Штамм аэробный, каталазоположительный и оксидазоотрицательный. Растёт на минимальном агаре с этанолом, ацетатом, аланином и аргинином но не с глюкозой, лактозой, рамнозой, арабинозой, сахарозой, мальтозой, галактозой, сорбитом, маннитом, дульцтом, инозитом, глицерином, цитратом, глицином, орнитином и гистидином. Небольшое количество кислоты образует при росте на питательном агаре с этанолом, но не с углеводами или с многоатомными спиртами. Не гидролизует желатин. Растёт при концентрации NaCl от 0 до 3%, рН 6.8 - 7.7, температуре от 4 до 30°C, но не при 37°C. Чувствителен к ампициллину, канамицину и хлорамфениколу, но устойчив к тетрациклину при концентрации антибиотика в питательном агаре 50 мкг/мл. В питательном бульоне Луриа без встряхивания культура образовывала гомогенную муть и осадок, а при концентрации NaCl 1.5 и 3% также и поверхностную плёнку. На питательном агаре колонии вырастали за 2 дня при 22°C и были круглые, расползающиеся до 2 см в диаметре, приплюснутые и немного выпуклые в центре, зернисто-блестящие, полупрозрачные, сероватые с салатным оттенком. Штамм идентифицировали по определителю [15] как вид бактерии Acinetobacter johnsonii R2, а его рестриктазу назвали AjnI по номенклатуре [18].
Содержание рестриктазы и нуклеазы в культуре определяли как описано (см. "Условия эксперимента"). На рис. 1. представлена калибровочная электрофореграмма для определения активности рестриктазы AjnI в лизате клеток. Полный специфический гидролиз субстратной ДНК виден в 3-х разведениях лизата. Активность AjnI в клетках после 48 ч выращивания соответствует 10 ед/ОП₅₅₀. В лизате клеток (дорожка 1) видно, что хозяйская ДНК содержит и плазмиды, в виде слабых полосок.

Рис. 1. Определение активности AjnI в лизате A. johnsonii R2 после 48 ч роста. 1 - лизат клеток при плотности 10 ОП₅₅₀, 2 - λ ДНК + лизат 10 ОП₅₅₀, 3 - 5, 4 - 2.5, 5 - 1.25, 6 - 0.6, 7 - 0.3, 8 - 0 (λ ДНК без лизата). М - маркер (λ ДНК/BssT1I)

Стадия роста культуры определяет урожай клеток, но от неё зависит и биосинтез целевого продукта. На рис. 2а видно, что в первые часы культивирования в клетках много нуклеазы, которая гидролизует ДНК до мелких фрагментов. Тем не менее, активность рестриктазы также проявляется, причём при разбавлении лизатов (рис. 2б) она видна во всех пробах. На рис. 3 видно, что стационарная фаза после 24 ч роста культуры представляется оптимальной для наработки биомассы, поскольку при наибольшем урожае клеток в них достаточно рестриктазы и уже нет нуклеаз. Кроме того, получать биомассу стационарной культуры технологически проще, чем логарифмической.

Рис. 2. Определение рестриктазы AjnI и нуклеазы у A. johnsonii R2 в процессе его роста: а - плотностью клеток для лизиса 5 ОП₅₅₀, б - 0.6 ОП₅₅₀. Время роста: 1 - начало роста (0 ч), 2 - 2 ч, 3 - 4 ч, 4 - 6 ч, 5 - 24 ч, 6 - 48 ч. М - маркер, λ ДНК/BssT1I

Рис. 3. Содержание нуклеазы и рестриктазы AjnI у A. johnsonii R2 в процессе роста

Биомассу A. johnsonii R2 выращивали при аэрации в модифицированном бульоне Лурия. Из 1 л получали 4 г клеток. Фермент выделяли из клеточного экстракта с помощью последовательных хроматографических процедур на колонках фосфоцеллюлозы Р11, гидроксилапатита и гепарин-сефарозы. Из 20 г клеток получали 3.5 мл препарата AjnI с активностью 5000 ед/мл.
Оптимальные условия действия рестриктазы AjnI определяли в пяти стандартных буферных смесях при 37°C и 55°C (см. таблицу). Фермент наиболее активен при 55°C в буфере Y (см. "Условия эксперимента").

Последовательность нуклеотидов ДНК, которую узнаёт рестриктаза AjnI, а также её отношение к dcm-метилированию определяли по картине фрагментации dcm- ДНК фага λ [19] и dcm+ ДНК плазмиды PBR322[20] (Рис. 4). Для сравнения использовали изошизомеры рестриктазы EcoRII, из которых Psp6I блокировалась dcm-метилированием, а Bst2UI - нет. Рестриктазы AjnI Bst2UI и Psp6I идентично расщепляли dcm- ДНК фага λ. Таким образом, AjnI узнаёт последовательность 5'-CCWGG-3'. Благодаря тому, что фаг был индуцирован из штамма E. coli JM110 дефектного по dcm-метилазе [21], его ДНК расщепляется рестриктазой Psp6I. Однако, подобно EcoRII, фермент Psp6I чувствителен к dcm-метилированию (5'-C(5mC)WGG-3') и не расщепляет dcm+ ДНК PBR322 из E. coli XL1-Blue [21]. Однако такую ДНК расщепляют рестриктазы Bst2UI и AjnI. Также как и BstNI рестриктаза AjnI термофильна и не блокируется dcm-метилированием, но также как EcoRII она обнаружена в мезофильном виде бактерии. Термофильные изошизомеры EcoRII известны, например: PspGI из термофила Pyrococcus species GI-H [22] или Psp6I, который мы нашли в мезофиле Pseudomonas species 6 (http://www.sibenzyme.ru). Однако, dcm-метилирование эти ферменты блокирует. Поскольку термофильная AjnI не блокируется dcm-метилированием, но обнаружена в мезофильном штамме, мы допустили, что она может отличаться от BstNI по месту гидролиза ДНК.

Рис. 4. Гидролиз ДНК для определения сайта узнаваемого рестриктазой AjnI, а также её отношения к dcm-метилированию ДНК: а - dcm- ДНК фага λ; б - dcm+ ДНК плазмиды pBR322; 1 - ДНК + Bst2UI; 2 - AjnI; 3 - Psp6I; 4 - исходная ДНК; М - маркер, λ ДНК/BssT1I.

Нуклеотиды, между которыми AjnI расщепляет цепи ДНК определяли на дезоксирибонуклеотидном дуплексе, содержащем сайт, который узнаёт рестриктаза (в рамке).

Для идентификации на электрофореграмме 3'-нуклеотидов дуплекс обрабатывали рестриктазой Bst2UI, расщепляющей 5'-CC↓WGG-3', а также экзонуклеазой III из E.coli. На рис. 5 видно, что рестриктаза AjnI расщепляет цепи дуплекса по 5'-↓CCWGG-3', что соответствует местам гидролиза ДНК рестриктазой EcoRII. Однако, в отличие от EcoRII, рестриктаза AjnI не блокируется dcm-метилированием ДНК, но является изошизомером рестриктазы EcoRII. В базе данных [http://rebase.neb.com] подобные изошизомеры EcoRII не отмечены. Мы полагаем, что обнаруженный нами фермент AjnI найдёт применение в молекулярно-генетических исследованиях.

Рис. 5. Определение нуклеотидов, между которыми AjnI гидролизует узнаваемую последовательность в олигонуклеотидном дуплексе: а - верхняя цепь помечена ³²Р по 5'-концу; б - помечена нижняя цепь; 1 - исходный дуплекс; 2 - дуплекс + Bst2UI (узнаёт и расщепляет 5'-CC↓WGG-3'); 3 - экзонуклеаза III, 4 - AjnI, 5 - Psp6I (5'-↓CCWGG-3')

ЛИТЕРАТУРА

1. Yoshimori, R.N. / In Ph.D. Thesis, University of California, San Francisco, USA. - 1971. - P. 1-73.
2. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. // Nucleic Acids Res. - 2002. - V. 31. - P. 418-420.
3. Bigger, C.H., Murray, K., Murray, N.E. // Nature New Biol. - 1973. - V. 244. - P. 7-10.
4. Buryanov Y.I., Bogdarina I.G., Bayev A.A.// FEBS Lett. - 1978. - V. 88. - P. 251-254.
5. Marinus M.G., Morris N.R. // J. Bacteriol. - 1973. - V. 114. - P. 1143-1150.
6. May M.S., Hattman S. // J. Bacteriol. - 1975. - V. 123. - P. 768-770.
7. Razin A., Urieli S., Pollack Y., et al. // Nucleic Acids Res. - 1980. - V. 8. - P. 1783-1792.
8. Янулайтис А., Ваиткевичус Д.П. // Биотехнология. - 1985. - №. 1. - С. 39-51.
9. Butkus, V., Klimasauskas, S., Kersulyte, et al. // Nucleic Acids Res. - 1985. - V. 13. - P. 5727-5746.
10. Барышев М.М., Бурьянов Я.И., Косых В.Г., Баев А.А. // Биохимия. - 1989. - Т. 54. - С. 1894-1903.
11. Buryanov, Ya.I., Baryshev, M.M., Kosykh, V.G., Bayev, A.A. // J. Cell Biochem. Suppl. - 1989. - V. 13D. - P. 211.
12. Дедков В.С., Погребняк В.Б. Определение эндонуклеаз рестрикции в лизатах из отдельных колоний бактерий и измерение активности BamHI, PstI и MspI у бактерий, выращенных на питательном агаре и в бульоне. Тез. докл. 6-го рабочего совещания по программе "Плазмида". Пущино на Оке. М., 1981. С. 50 51.
13. Дедков В.С., Дегтярёв С.Х. // Приклад. биохим. 1992. Т. 28. С. 309-313.
14. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. / Под ред. Н. С. Егорова М., 1995.
15. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Хоулта Дж. и др.: 9-е издание в 2-х томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина, М., 1997.
16. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М., 1984.
17. Горбунов Ю.А., Зиновьев В.В., Овечкина Л.Г. и др. // Биоорган. химия. 1987. Т. 13. С. 1629 1637.
18. Smith H.O., Nathans D.// J. Mol. Biol. 1973. V. 81. P. 419 423.
19. Sanger F., Coulson A.R., Hong G.F. et al.// J. Mol. Biol. 1982. V. 162. P. 729 773.
20. Sutcliffe J.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 3737-3741.
21. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual: Second Edition, CSH, USA. - 1989. - V. 3. - Appendix A.9-A.13.
22. Morgan, R., Xiao, J.-P., Xu, S.-Y. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - V. 64. - P. 3669-3673.