Биотехнология, 2004, № 3, С. 19-24
Из природных изолятов был выделен новый продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), идентифицированный как вид Acinetobacter johnsonii R2, а его рестриктаза названа AjnI. Описан способ очистки и оценки активности фермента. Показано, что рестриктаза AjnI образует фрагменты ДНК с 5’-CCWGG выступающими концами, как и EcoRII, но не блокируется dcm-метилированием. Рестриктаза AjnI может найти широкое применение в генетической инженерии.
Ферменты рестрикции - модификации EcoRII открыты и изучены в числе первых RM-систем [1, 2]. Эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза) EcoRII расщепляет ДНК по сайту 5'-↓CCWGG-3' (W - A или T), образуя 5'-выступающие концы из 5-и нуклеотидов [3]. ДНК метилтрансфераза M.EcoRII защищает хозяйскую ДНК от своей рестриктазы, модифицируя внутренний цитозин в последовательности 5'-C(5mC)WGG-3' на обеих цепях ДНК [1, 4]. Многие лабораторные штаммы E. coli имеют dcm-метилтрансферазу [5, 6], которая модифицирует ДНК идентично M.EcoRII. Плазмиды, выделенные из таких штаммов, устойчивы к действию рестриктазы EcoRII и её изошизомеров, что ограничивает применение этих ферментов в генетической инженерии. Неошизомеры рестриктазы EcoRII, подобные ApyI [7], MvaI [8, 9] и BstNI [10, 11], не блокируются dcm-метилированием, но расщепляют ту же последовательность ДНК иначе, по сайту 5'-CC↓WGG-3'. Такие изошизомеры во многих случаях могут заменить прототип, однако, не во всех. В генетической инженерии, например при получении геномных библиотек, удобно линеаризовать вектор крупнощепящей рестриктазой, а донорную ДНК фрагментировать мелкощепящим ферментом, образующим комплементарные концы ДНК. Не смотря на большое число прототипов, подобрать такую пару ферментов не просто, особенно если желательны выступающие 5'-концы. Такую пару могут составить рестриктазы SexAI (узнаёт 5-A↓CCWGGT-3') и EcoRII (узнаёт 5-↓CCWGG-3'). К сожалению, оба фермента чувствительны к dcm-метилированию. Недавно обнаруженный нами фермент MabI - изошизомер рестриктазы SexAI, не блокируется dcm-метилированием, но подобных изошизомеров рестриктазы EcoRII ранее обнаружено не было.
Целью данной работы было получение и изучение некоторых свойств новой рестриктазы AjnI из бактерии Acinetobacter johnsonii R2, которая является изошизомером EcoRII и не чувствительна к dcm-метилированию.
Штамм A. johnsonii R2 выделен нами из пресной воды при поиске рестриктаз по методике [12, 13]. Морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [14]. Определение микроорганизма до вида проводили по определителю [15].
A. johnsonii R2 выращивали до насыщения в 24-х качалочных колбах объёмом по 700 мл, содержащих по 300 мл среды, содержащей: 1% триптона (Organotechnie, Франция), 0.5% дрожжевого экстракта (той же фирмы), 0.5% NaCl, 0.05% MgCl2, 0.001% тиамина, рН 7.5 в инкубаторе G-25 (New Brunswick, США) при 28°C со встряхиванием 170 об/мин в течение 20 ч. Клетки (33 г) осаждали центрифугированием при 8000 об/мин и замораживали.
Для определения стадии роста культуры оптимальной для выделения рестриктазы измеряли в пробах оптическую плотность при 550 нм в 1 см (ОП550). Клетки из 1 мл осаждали и замораживали. Осадки суспензировали до 10 ОП550 в буфере, содержащем 0.02% лизоцим (Serva, Германия), 0.1% тритон Х-100 в ТЕ-буфере: 10 мМ трис-HCl (рН 7.7) и 1 мМ ЭДТА. Лизис проводили 0.5 ч при 22°C. 100 мкл лизата дополняли буфером Y (см. далее) и 60 мкл отбирали в ячейку, содержащую 6 мкл λ ДНК (500 мкг/мл в ТЕ-буфере). Делали 5 последовательных 2-кратных разведений в пробах по 30 мкл смеси, содержащей 50 мкг/мл λ ДНК в буфере Y. Пробы инкубировали 2 ч при 55°C и анализировали мини-электрофорезом в 1% агарозе в трис-ацетатном буфере с этидийбромидом (0.5 мг/л) при напряжении 5В/см за 70 мин по методике [16]. Маркёром длин ДНК служила λ ДНК, фрагментированная BssT1I. За единицу активности AjnI принимали полное специфическое расщепление ферментом 1 мкг ДНК фага λ за 1 ч в этих условиях, а за единицу активности нуклеаз - гидролиз ДНК до 100 н.п. Обе активности относили к единице ОП550 в 1 мл.
Выделение рестриктазы AjnI проводили при 4°С. Все растворы содержали 10 мМ К фосфатный буфер (рН 7.2), 7 мМ β-меркаптоэтанол и 0.1 мМ ЭДТА. 20 г клеток суспензировали в 60 мл 0.2 М NaCl с 0.03% лизоцимом и инкубировали 16 ч. Клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали при 15000 об/мин 40 мин. Экстракт разбавляли 2-мя объёмами буфера и пропускали через колонку с фосфоцеллюлозой Р11 (Whatman, Англия) объёмом 40 мл. Нуклеазы не задерживались. Колонку промывали 0.05 М NaCl, затем градиентом NaCl от 0.05 до 0.6 М (объёмом 400 мл). Элюат собирали в 50 пробирок. Фракции 17-23, содержащие фермент, объединяли и наносили на колонку с 5 мл гидроксилапатита и промывали 0.2 M NaCl. Фермент смывали в градиенте К фосфатного буфера в концентрации от 0.01 до 0.25 М объёмом 120 мл в 50 пробирок. Фракции 18-23 диализовали 1 ч против 1 мМ K2HPO4, наносили на колонку с 4 мл гепарин-сефарозы (Sigma, США) и промывали её 0.05 М NaCl. Фермент смывали в градиенте NaCl от 0.05 до 0.6 М объёмом 100 мл в 50 пробирок. Фракции 18-24 диализовали против буфера с 50%-ным глицерином и хранили при -20°C.
Оптимальные условия активности рестриктазы определяли путём расщепления ДНК фага λ (50 мкг/мл в 50 мкл) при 37 и 55°C в 5 стандартных буферных растворах: буфер В - 10 мМ трис-HCl (pH 7.6 при 25°С), 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ; буфер G - 10 мМ трис-HCl (pH 7.6), 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер O - 50 мМ трис-HCl (pH 7.6), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер W - 10 мМ трис-HCl (pH 8.5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер Y - 33 мМ трис-ацетат (pH 7.9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия и 1 мМ ДТТ. Инкубацию проб проводили 1 ч и анализировали электрофорезом. Затем в оптимальном буфере активность определяли при 30, 40, 50, 60 и 70°C.
Для определения места расщепления ДНК рестриктазой использовали синтетический дуплекс с последовательностью, узнаваемой AjnI. Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы по методике [17]. По методикам [16] каждую цепь метили по 5'-концу при помощи Т4 полинуклеотидкиназы и γ-32P-АТФ и гибридизовали с немеченой комплементарной цепью. Полученные таким образом меченые модификации дуплекса расщепляли рестриктазами AjnI, а также Psp6I и Bst2UI. Фрагменты разделяли электрофорезом в 20%-ном ПААГ с 7 М мочевиной. Гель сканировали на приборе "Cyclone"(Packard, США). Для контроля разделения фрагментов по нуклеотидам дуплекс обрабатывали экзонуклеазой III из E.coli.
Препараты ферментов: рестриктаз Bst2UI и Psp6I, экзонуклеазы III из E.coli и Т4 полинуклеотидкиназы; а также препараты ДНК: фага λ, плазмиды PBR322 и маркёра λ/BssT1I, использованные в работе, произведены в НПО "СибЭнзим".
Бактериальный штамм продуцент рестриктазы AjnI имеет следующие характеристики. Клетки неподвижные короткие палочки размером 1.3х2 мкм; располагаются одиночно, попарно, а также цепочками; спор не образуют. По Граму окрашиваются отрицательно и выглядят как кокки располагающиеся парами. Штамм аэробный, каталазоположительный и оксидазоотрицательный. Растёт на минимальном агаре с этанолом, ацетатом, аланином и аргинином но не с глюкозой, лактозой, рамнозой, арабинозой, сахарозой, мальтозой, галактозой, сорбитом, маннитом, дульцтом, инозитом, глицерином, цитратом, глицином, орнитином и гистидином. Небольшое количество кислоты образует при росте на питательном агаре с этанолом, но не с углеводами или с многоатомными спиртами. Не гидролизует желатин. Растёт при концентрации NaCl от 0 до 3%, рН 6.8 - 7.7, температуре от 4 до 30°C, но не при 37°C. Чувствителен к ампициллину, канамицину и хлорамфениколу, но устойчив к тетрациклину при концентрации антибиотика в питательном агаре 50 мкг/мл. В питательном бульоне Луриа без встряхивания культура образовывала гомогенную муть и осадок, а при концентрации NaCl 1.5 и 3% также и поверхностную плёнку. На питательном агаре колонии вырастали за 2 дня при 22°C и были круглые, расползающиеся до 2 см в диаметре, приплюснутые и немного выпуклые в центре, зернисто-блестящие, полупрозрачные, сероватые с салатным оттенком. Штамм идентифицировали по определителю [15] как вид бактерии Acinetobacter johnsonii R2, а его рестриктазу назвали AjnI по номенклатуре [18].
Содержание рестриктазы и нуклеазы в культуре определяли как описано (см. "Условия эксперимента"). На рис. 1. представлена калибровочная электрофореграмма для определения активности рестриктазы AjnI в лизате клеток. Полный специфический гидролиз субстратной ДНК виден в 3-х разведениях лизата. Активность AjnI в клетках после 48 ч выращивания соответствует 10 ед/ОП550. В лизате клеток (дорожка 1) видно, что хозяйская ДНК содержит и плазмиды, в виде слабых полосок.
Рис. 1. Определение активности AjnI в лизате A. johnsonii R2 после 48 ч роста. 1 - лизат клеток при плотности 10 ОП550, 2 - λ ДНК + лизат 10 ОП550, 3 - 5, 4 - 2.5, 5 - 1.25, 6 - 0.6, 7 - 0.3, 8 - 0 (λ ДНК без лизата). М - маркер (λ ДНК/BssT1I)
Стадия роста культуры определяет урожай клеток, но от неё зависит и биосинтез целевого продукта. На рис. 2а видно, что в первые часы культивирования в клетках много нуклеазы, которая гидролизует ДНК до мелких фрагментов. Тем не менее, активность рестриктазы также проявляется, причём при разбавлении лизатов (рис. 2б) она видна во всех пробах. На рис. 3 видно, что стационарная фаза после 24 ч роста культуры представляется оптимальной для наработки биомассы, поскольку при наибольшем урожае клеток в них достаточно рестриктазы и уже нет нуклеаз. Кроме того, получать биомассу стационарной культуры технологически проще, чем логарифмической.
Рис. 2. Определение рестриктазы AjnI и нуклеазы у A. johnsonii R2 в процессе его роста: а - плотностью клеток для лизиса 5 ОП550, б - 0.6 ОП550. Время роста: 1 - начало роста (0 ч), 2 - 2 ч, 3 - 4 ч, 4 - 6 ч, 5 - 24 ч, 6 - 48 ч. М - маркер, λ ДНК/BssT1I
Рис. 3. Содержание нуклеазы и рестриктазы AjnI у A. johnsonii R2 в процессе роста
Биомассу A. johnsonii R2 выращивали при аэрации в модифицированном бульоне Лурия. Из 1 л получали 4 г клеток. Фермент выделяли из клеточного экстракта с помощью последовательных хроматографических процедур на колонках фосфоцеллюлозы Р11, гидроксилапатита и гепарин-сефарозы. Из 20 г клеток получали 3.5 мл препарата AjnI с активностью 5000 ед/мл.
Оптимальные условия действия рестриктазы AjnI определяли в пяти стандартных буферных смесях при 37°C и 55°C (см. таблицу). Фермент наиболее активен при 55°C в буфере Y (см. "Условия эксперимента").
Температура,°С
|
Активность AjnI в различных буферах, %
|
||||
B
|
G
|
O
|
W
|
Y
|
|
37
|
3
|
6
|
6
|
25
|
25
|
55
|
75
|
50
|
12
|
75
|
100
|
Последовательность нуклеотидов ДНК, которую узнаёт рестриктаза AjnI, а также её отношение к dcm-метилированию определяли по картине фрагментации dcm- ДНК фага λ [19] и dcm+ ДНК плазмиды PBR322[20] (Рис. 4). Для сравнения использовали изошизомеры рестриктазы EcoRII, из которых Psp6I блокировалась dcm-метилированием, а Bst2UI - нет. Рестриктазы AjnI Bst2UI и Psp6I идентично расщепляли dcm- ДНК фага λ. Таким образом, AjnI узнаёт последовательность 5'-CCWGG-3'. Благодаря тому, что фаг был индуцирован из штамма E. coli JM110 дефектного по dcm-метилазе [21], его ДНК расщепляется рестриктазой Psp6I. Однако, подобно EcoRII, фермент Psp6I чувствителен к dcm-метилированию (5'-C(5mC)WGG-3') и не расщепляет dcm+ ДНК PBR322 из E. coli XL1-Blue [21]. Однако такую ДНК расщепляют рестриктазы Bst2UI и AjnI. Также как и BstNI рестриктаза AjnI термофильна и не блокируется dcm-метилированием, но также как EcoRII она обнаружена в мезофильном виде бактерии. Термофильные изошизомеры EcoRII известны, например: PspGI из термофила Pyrococcus species GI-H [22] или Psp6I, который мы нашли в мезофиле Pseudomonas species 6 (http://www.sibenzyme.ru). Однако, dcm-метилирование эти ферменты блокирует. Поскольку термофильная AjnI не блокируется dcm-метилированием, но обнаружена в мезофильном штамме, мы допустили, что она может отличаться от BstNI по месту гидролиза ДНК.
Рис. 4. Гидролиз ДНК для определения сайта узнаваемого рестриктазой AjnI, а также её отношения к dcm-метилированию ДНК: а - dcm- ДНК фага λ; б - dcm+ ДНК плазмиды pBR322; 1 - ДНК + Bst2UI; 2 - AjnI; 3 - Psp6I; 4 - исходная ДНК; М - маркер, λ ДНК/BssT1I.
Нуклеотиды, между которыми AjnI расщепляет цепи ДНК определяли на дезоксирибонуклеотидном дуплексе, содержащем сайт, который узнаёт рестриктаза (в рамке).
5'-AAGGTCA 3'-TTCCAGT |
CCTGG GGACC |
GACGAACGCGTCGACCGGTATACTAA-3' CTGCTTGCGCAGCTGGCCATATGATT-5' |
Для идентификации на электрофореграмме 3'-нуклеотидов дуплекс обрабатывали рестриктазой Bst2UI, расщепляющей 5'-CC↓WGG-3', а также экзонуклеазой III из E.coli. На рис. 5 видно, что рестриктаза AjnI расщепляет цепи дуплекса по 5'-↓CCWGG-3', что соответствует местам гидролиза ДНК рестриктазой EcoRII. Однако, в отличие от EcoRII, рестриктаза AjnI не блокируется dcm-метилированием ДНК, но является изошизомером рестриктазы EcoRII. В базе данных [http://rebase.neb.com] подобные изошизомеры EcoRII не отмечены. Мы полагаем, что обнаруженный нами фермент AjnI найдёт применение в молекулярно-генетических исследованиях.
Рис. 5. Определение нуклеотидов, между которыми AjnI гидролизует узнаваемую последовательность в олигонуклеотидном дуплексе: а - верхняя цепь помечена 32Р по 5'-концу; б - помечена нижняя цепь; 1 - исходный дуплекс; 2 - дуплекс + Bst2UI (узнаёт и расщепляет 5'-CC↓WGG-3'); 3 - экзонуклеаза III, 4 - AjnI, 5 - Psp6I (5'-↓CCWGG-3')