Эндонуклеаза рестрикции ВmtI из Bacillus megaterium S2 расщепляет ДНК по 5'-GCTAG^C-3

Категория: Новые ферменты

Просмотров: 6261

Обнаружен новый штамм - продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) BmtI, который был идентифицирован как бактериальный вид Bacillus megaterium S2. Описаны схема очистки фермента и некоторые его свойства. Показано, что рестриктаза BmtI является гетерошизомером хорошо известного фермента NheI (расщепляет 5'-G^CTAGC-3') и разрушает ДНК, образуя фрагменты с выступающими CTAG-3'- концами. Рестриктаза BmtI может быть использована в генетической инженерии.

Эндонуклеаза рестрикции типа II (рестриктаза) NheI из Neisseria mucosa heidelbergensis узнает и расщепляет в ДНК последовательность 5'-G^CTAGC-3' [1]. В других видах бактерий обнаружены немногие изошизомеры этой рестриктазы, которые узнают и расщепляют последовательность ДНК идентично прототипу. К ним относится изошизомер AsuNHI, обнаруженный нами в штамме Actinobacillus suis NH [2]. В базе данных (http://www.rebase. com) указан и гетерошизомер рестриктазы NheI, который по-другому расщепляет узнаваемую последовательность: AceII из цианобактерии Anabaena cedrorum, расщепляющий 5'-GCTAG^C-3'. Однако гетерошизомеры NheI в настоящее время в литературе не описаны и не производятся.
Целью данной работы было получение из штамма Bacillus megaterium S2 рестриктазы BmtI и ее изучение. Показано, что новый фермент является гетерошизомером рестриктазы NheI.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Штамм В. megaterium S2 выявлен нами в пробе грунта при поиске рестриктаз по ранее описанной методике [3], [4]. Морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [5]. Определение штамма до вида проводили по определителю [6].
Концентрацию белка при выделении рестриктазы определяли по разности оптической плотности при 228,5 и 234,5 нм по методу [7].
За единицу активности BmtI принимали количество фермента, способное осуществлять полное специфическое расщепление 1 мкг ДНК фага λ (предварительно обработанной рестриктазой HindIII) за 1 ч при 37° в 20 мкл буфера W с БСА: 10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ с 50 мкг/мл ацетилированного БСА (Promega, США). Реакцию останавливали добавлением по 5 мкл стоп-буфера: 0,25 М Na-ЭДТА, рН 8,5, 50% сахароза и 0,25% бромфеноловый синий. Фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 1%-ной агарозе (Qualex Gold™, Hybaid-AGS, Германия) в трис-ацетатном буфере с этидийбромидом (0,5 мг/л) при напряжении 5 В/см за 1,5 ч по методике [8].
Оптимальные условия активности рестриктазы определяли путем расщепления 2,5 мкг ДНК фага λ (предварительно обработанной рестриктазой HindIII) при 37° и 55° в пяти стандартных буферных растворах (объем пробы 50 мкл): буфер В - 10 мМ трис-HCl (рН 7,6 при 25°), 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ ДТТ; буфер G - 10 мМ трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер О - 50 мМ трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер W - 10 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер Y-33 мМ трис-ацетат (рН 7,9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия и 1 мМ ДТТ. Пробы инкубировали 1 ч и анализировали с помощью электрофореза. Затем в оптимальном буфере активность определяли при 30°, 40, 50 и 60°.
Последовательность нуклеотидов, которую узнает рестриктаза BmtI, идентифицировали по картине фрагментации ферментом канонических ДНК. В качестве препарата фермента использовали лизат клеток агаровой культуры по методике [4]. Расщепление 50 мкг/мл ДНК проводили 1 ч при 37° в буфере W. Электрофорез ДНК проводили 4 ч в 0,7%-ной агарозе при напряжении 5 В/см, используя в качестве маркера гидролизат λ-ДНК/BssT1I (StyI).
Для определения места расщепления ДНК рестриктазой BmtI использовали дуплекс из олигодезоксирибонуклеотидов (000«СибЭнзим», г. Новосибирск). По методикам [8] каждую цепь метили по 5'-концу при помощи Т4 полинуклеотидкиназы и γ-³²Р-АТР и гибридизовали с немеченой комплементарной цепью. Полученные таким образом меченые модификации дуплекса расщепляли рестриктазой BmtI, а также AsuNHI (изошизомер NheI), разделяли фрагменты электрофорезом в 20%-ном ПААГ с 6 М мочевиной и делали радиоавтограф. Для контроля разделения фрагментов по длине нуклеотидов дуплекс обрабатывали экзонуклеазой III из E. coli.
Препараты ферментов (рестриктаза AsuNHI, экзонуклеаза III, Т4 полинуклеотидкиназа из Е. coli), а также ДНК (фага λ, аденовируса-2, маркеров λ/BssT1l и λ/HindIII), использованные в работе, произведены в ООО «СибЭнзим» (Новосибирск, http://www.sibenzyme.ru).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Бактериальный штамм - продуцент рестриктазы BmtI, имеет следующие характеристики. Клетки, неподвижные грамположительные палочки размером (1-1,2)х(2-4) мкм, располагаются поодиночке и в коротких изломанных цепочках. Клетки образуют эллипсовидные споры без параспоральных телец и не раздувают спорангии. Штамм аэробный, каталазоположительный, оксидазоотрицательный, восстанавливает нитрат в нитрит. Не расщепляет крахмал, казеин и твин-80. Не образует ацетон из глюкозы. Заметное количество кислоты образует из рамнозы, но не окисляет маннит, этанол, глюкозу, галактозу, сахарозу, дульцит, сорбит, мальтозу, инозит, ацетат, глицерин, арабинозу и лактозу. На минеральной среде с углеводами не растет. На питательном агаре Луриа растет при рН 7-8, температуре от 4 до 40°, концентрации NaCl от 0 до 2 %. Колонии на питательном агаре круглые, 3-7 мм в диаметре, выпуклые, блестящие, серого цвета. Штамм идентифицировали по определителю [6] как вид бактерии Bacillus megaterium S2, а его рестриктазу назвали BmtI согласно номенклатуре [9].
В. megaterium S2 выращивали в 24 качалочных колбах емкостью 500 мл с 300 мл бульона, состоящего из 1% триптона (Organotechnie, Франция), 0,5% дрожжевого экстракта (той же фирмы), 0,5% NaCl, 0,05% MgCl₂, 0,001% тиамина, рН 7,5, в инкубационной емкости G-25 (New Brunswick, США) при 30° со встряхиванием (170 об/мин 20 ч). Клетки осаждали 20 мин в центрифуге J-21C (Beckman, США) с использованием ротора JA-10 при 8000 об/мин. Получили 103 г полужидкой биомассы, которую замораживали и хранили при -20°.
Выделение рестриктазы BmtI проводили по схеме [10] при 4° в смеси, содержащей 10 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,2, 7 мМ β-меркаптоэтанол и 0,1 мМ ЭДТА. 10 г клеток суспендировали в 30 мл буфера с 0,05 М NaCl, 0,05% лизоцима и 0,05% PMSF, инкубировали 1,5 ч, разрушали ультразвуком и осветляли при 15000 об/мин 30 мин. Экстракт пропускали через колонку фосфоцеллюлозы P11 (Whatman, Англия) объемом 30 мл, колонку промывали сначала 60 мл 0,05 М NaCl, затем 300 мл градиента концентрации NaCl от 0,05 до 0,8 М. Элюат собирали в 25 пробирок. Фракции 19-22, содержащие фермент, объединяли, наносили на колонку с 3,5 мл гидроксилапатита и промывали 10 мл 0,2 М NaCl. Фермент смывали 200 мл градиента концентрации К-фосфатного буфера, рН 7,2, от 0,01 до 0,25 М в 50 пробирок. Фракции 15-21 диализовали против буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,6, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,25 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА и 50% глицерина. Получили 7,5 мл препарата, который хранили при -20°. Результаты выделения суммированы в табл. 1.

Таблица 1. Выделение рестриктазы BmtI из 10 г биомассы

Из 10 г клеток после их разрушения и хроматографической очистки на фосфоцеллюлозе Р11 и гидроксилапатите получали 7,5 мл препарата BmtI с активностью 30000 ед/мл. Выход фермента составил 26% при очистке по белку в 375 раз.
Оптимальные условия действия рестриктазы BmtI определяли в пяти стандартных буферных смесях при 37° и 55° (табл. 2). Фермент наиболее активен при 37° в буфере W (см. «Условия эксперимента»). В отличие от NheI и ее изошизомеров, рестриктаза BmtI малоактивна в буфере В при низкой ионной силе.

Таблица 2 Относительная активность BmtI при расщеплении λ/HindIII ДНК при 37° и 55° в пяти стандартных буферах

Сайт ДНК, который узнает BmtI, идентифицировали по картине фрагментации ДНК фага λ [11] и аденовируса-2 [12], нуклеотидные последовательности которых известны. На рис. 1 видно, что BmtI узнает последовательность 5'-GCTAGC-3', как и ее прототип NheI [1].

Рис. 1. Расщепление канонических ДНК лизатом клеток В. megaterium S2 для идентификации сайта ДНК, который узнает рестриктаза BmtI:
1—лизат
2—лизат + ДНК фага λ
3 — ДНК аденовируса-2
М— маркер, λ-ДНК/BssT1I (StyI)

Связь каких именно нуклеотидов между собой расщепляет BmtI определяли с использованием дезоксирибонуклеотидного дуплекса, содержащего сайт узнавания рестриктазы (выделен):

Для идентификации на электрофореграмме 3'-концевых нуклеотидов дуплекс обрабатывали рестриктазой AsuNHI, расщепляющей 5'-G↑CTAGC-3', а также экзонуклеазой III из Е. coli.
На рис. 2 видно, что рестриктаза BmtI расщепляет цепи дуплекса по 5'-GCTAG↑C-3'. Таким образом, BmtI является гетерошизомером рестриктаз AsuNHI и NheI, которые расщепляют ДНК по последовательности 5'-G↑CTAGC-3'. Известен фермент AceII, расщепляющий ДНК аналогично BmtI, однако он коммерчески недоступен и его свойства не описаны в литературе. Мы полагаем, что обнаруженный нами фермент BmtI найдет применение в молекулярно-генетических исследованиях.

Рис. 2. Определение нуклеотидов дуплекса известного состава (см. текст), связь между которыми гидролизует BmtI: а- верхняя цепь олигонуклеотидного дуплекса помечена ³²Р по 5'-концу; б - нижняя цепь дуплекса помечена Р.
Использованные ферменты:
1 — BmtI,
2 — экзонуклеаза III;
3 — AsuNHI (узнает и расщепляет 5'-G^CTAGC-3'),
д — исходный дуплекс

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДТТ — дитиотреитол;
БСА — бычий сывороточный альбумин;
PMSF — параметилсульфонилфторид

ЛИТЕРАТУРА

1. Xu, S., Xiao, J. European Patent Office. ЕР 1096015, 2001.
2. Dedkov, V. S., Degtyarev, S. Kh. // Biol. Chem. (F. Hoppe—Seyler). — 1998. — V. 379. — P. 573—574.
3. Дедков В. С, Погребняк В.Б. Определение эндонуклеаз рестрикции в лизатах из отдельных колоний бактерий и измерение активности BamHI, PstI и MspI у бактерий, выращенных на питательном агаре и в бульоне. Тез. докл. 6-го рабочего совещания по программе «Плазмида». Пущино-на-Оке. — М., — 1981. — С. 50—51.
4. Дедков B.C., Дегтярёв С.Х. // Приклад, биохим. — 1992.—Т. 28. —С. 309—313. (интернет-версия)
5. Руководство к практическим занятиям по микробиологии // Под ред. Н. С. Егорова. — М., 1995.
6. Краткий определитель бактерий Берги // Под ред. Дж. Хоулта. 9-е изд. Пер. с англ. канд. биол. наук С. Ш. Тер-Казарьяна / Под ред. чл.-корр. АН СССР Г.А. Заварзина. — М, 1980.
7. Ehresmann, В.Н., Imbalt, P., Well, I.H. // Anal. Biochem. — 1973. —V. 54. —P. 454—463.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. — М., 1984.
9. Smith, И.О., Nathans, D. // J. Mol. Biol. —1973. —V. 81. — P. 419—423.
10. Greene, P. J., Heyneker, H.L., Bolivar, F., et al. // Nucleic Acids Res. — 1978. — V. 5. — P. 2373—2380.
11. Sanger, F., Coulson, A.R., Hong, G.F., et al. // J. Mol. Biol. — 1982. —V. 162. — P. 729—773.
12. Roberts, R.J., Akisjarvi, G., Alestrom, P., et al. Adenovirus DNA. // Ed. W. Doerfler. - Boston, Lancaster: Martinus Nijhoff Publishing, 1986. —P. 151.