function keepAlive() { var myAjax = new Request({method: "get", url: "index.php"}).send();} window.addEvent("domready", function(){ keepAlive.periodical(3600000); });
Главная  //  Научные статьи  //  Новые ферменты  //  Эндонуклеаза рестрикции ВmtI из Bacillus megaterium S2 расщепляет ДНК по 5'-GCTAG^C-3

Эндонуклеаза рестрикции ВmtI из Bacillus megaterium S2 расщепляет ДНК по 5'-GCTAG^C-3

 

В.C. Дедков, Т.Н. Наякшина, Д.В. Попиченко, C.X. Дегтярёв

Биотехнология, 2003, №1, с 11-15

 

Обнаружен новый штамм - продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) BmtI, который был идентифицирован как бактериальный вид Bacillus megaterium S2. Описаны схема очистки фермента и некоторые его свойства. Показано, что рестриктаза BmtI является гетерошизомером хорошо известного фермента NheI (расщепляет 5'-G^CTAGC-3') и разрушает ДНК, образуя фрагменты с выступающими CTAG-3'- концами. Рестриктаза BmtI может быть использована в генетической инженерии.

 

Эндонуклеаза рестрикции типа II (рестриктаза) NheI из Neisseria mucosa heidelbergensis узнает и расщепляет в ДНК последовательность 5'-G^CTAGC-3' [1]. В других видах бактерий обнаружены немногие изошизомеры этой рестриктазы, которые узнают и расщепляют последовательность ДНК идентично прототипу. К ним относится изошизомер AsuNHI, обнаруженный нами в штамме Actinobacillus suis NH [2]. В базе данных (http://www.rebase. com) указан и гетерошизомер рестриктазы NheI, который по-другому расщепляет узнаваемую последовательность: AceII из цианобактерии Anabaena cedrorum, расщепляющий 5'-GCTAG^C-3'. Однако гетерошизомеры NheI в настоящее время в литературе не описаны и не производятся.
Целью данной работы было получение из штамма Bacillus megaterium S2 рестриктазы BmtI и ее изучение. Показано, что новый фермент является гетерошизомером рестриктазы NheI.

 

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Штамм В. megaterium S2 выявлен нами в пробе грунта при поиске рестриктаз по ранее описанной методике [3], [4]. Морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [5]. Определение штамма до вида проводили по определителю [6].
Концентрацию белка при выделении рестриктазы определяли по разности оптической плотности при 228,5 и 234,5 нм по методу [7].
За единицу активности BmtI принимали количество фермента, способное осуществлять полное специфическое расщепление 1 мкг ДНК фага λ (предварительно обработанной рестриктазой HindIII) за 1 ч при 37° в 20 мкл буфера W с БСА: 10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ с 50 мкг/мл ацетилированного БСА (Promega, США). Реакцию останавливали добавлением по 5 мкл стоп-буфера: 0,25 М Na-ЭДТА, рН 8,5, 50% сахароза и 0,25% бромфеноловый синий. Фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 1%-ной агарозе (Qualex Gold™, Hybaid-AGS, Германия) в трис-ацетатном буфере с этидийбромидом (0,5 мг/л) при напряжении 5 В/см за 1,5 ч по методике [8].
Оптимальные условия активности рестриктазы определяли путем расщепления 2,5 мкг ДНК фага λ (предварительно обработанной рестриктазой HindIII) при 37° и 55° в пяти стандартных буферных растворах (объем пробы 50 мкл): буфер В - 10 мМ трис-HCl (рН 7,6 при 25°), 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ДТТ; буфер G - 10 мМ трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер О - 50 мМ трис-HCl (рН 7,6), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер W - 10 мМ трис-HCl (рН 8,5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ; буфер Y-33 мМ трис-ацетат (рН 7,9), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия и 1 мМ ДТТ. Пробы инкубировали 1 ч и анализировали с помощью электрофореза. Затем в оптимальном буфере активность определяли при 30°, 40, 50 и 60°.
Последовательность нуклеотидов, которую узнает рестриктаза BmtI, идентифицировали по картине фрагментации ферментом канонических ДНК. В качестве препарата фермента использовали лизат клеток агаровой культуры по методике [4]. Расщепление 50 мкг/мл ДНК проводили 1 ч при 37° в буфере W. Электрофорез ДНК проводили 4 ч в 0,7%-ной агарозе при напряжении 5 В/см, используя в качестве маркера гидролизат λ-ДНК/BssT1I (StyI).
Для определения места расщепления ДНК рестриктазой BmtI использовали дуплекс из олигодезоксирибонуклеотидов (000«СибЭнзим», г. Новосибирск). По методикам [8] каждую цепь метили по 5'-концу при помощи Т4 полинуклеотидкиназы и γ-32Р-АТР и гибридизовали с немеченой комплементарной цепью. Полученные таким образом меченые модификации дуплекса расщепляли рестриктазой BmtI, а также AsuNHI (изошизомер NheI), разделяли фрагменты электрофорезом в 20%-ном ПААГ с 6 М мочевиной и делали радиоавтограф. Для контроля разделения фрагментов по длине нуклеотидов дуплекс обрабатывали экзонуклеазой III из E. coli.
Препараты ферментов (рестриктаза AsuNHI, экзонуклеаза III, Т4 полинуклеотидкиназа из Е. coli), а также ДНК (фага λ, аденовируса-2, маркеров λ/BssT1l и λ/HindIII), использованные в работе, произведены в ООО «СибЭнзим» (Новосибирск, http://www.sibenzyme.ru).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Бактериальный штамм - продуцент рестриктазы BmtI, имеет следующие характеристики. Клетки, неподвижные грамположительные палочки размером (1-1,2)х(2-4) мкм, располагаются поодиночке и в коротких изломанных цепочках. Клетки образуют эллипсовидные споры без параспоральных телец и не раздувают спорангии. Штамм аэробный, каталазоположительный, оксидазоотрицательный, восстанавливает нитрат в нитрит. Не расщепляет крахмал, казеин и твин-80. Не образует ацетон из глюкозы. Заметное количество кислоты образует из рамнозы, но не окисляет маннит, этанол, глюкозу, галактозу, сахарозу, дульцит, сорбит, мальтозу, инозит, ацетат, глицерин, арабинозу и лактозу. На минеральной среде с углеводами не растет. На питательном агаре Луриа растет при рН 7-8, температуре от 4 до 40°, концентрации NaCl от 0 до 2 %. Колонии на питательном агаре круглые, 3-7 мм в диаметре, выпуклые, блестящие, серого цвета. Штамм идентифицировали по определителю [6] как вид бактерии Bacillus megaterium S2, а его рестриктазу назвали BmtI согласно номенклатуре [9].
В. megaterium S2 выращивали в 24 качалочных колбах емкостью 500 мл с 300 мл бульона, состоящего из 1% триптона (Organotechnie, Франция), 0,5% дрожжевого экстракта (той же фирмы), 0,5% NaCl, 0,05% MgCl2, 0,001% тиамина, рН 7,5, в инкубационной емкости G-25 (New Brunswick, США) при 30° со встряхиванием (170 об/мин 20 ч). Клетки осаждали 20 мин в центрифуге J-21C (Beckman, США) с использованием ротора JA-10 при 8000 об/мин. Получили 103 г полужидкой биомассы, которую замораживали и хранили при -20°.
Выделение рестриктазы BmtI проводили по схеме [10] при 4° в смеси, содержащей 10 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,2, 7 мМ β-меркаптоэтанол и 0,1 мМ ЭДТА. 10 г клеток суспендировали в 30 мл буфера с 0,05 М NaCl, 0,05% лизоцима и 0,05% PMSF, инкубировали 1,5 ч, разрушали ультразвуком и осветляли при 15000 об/мин 30 мин. Экстракт пропускали через колонку фосфоцеллюлозы P11 (Whatman, Англия) объемом 30 мл, колонку промывали сначала 60 мл 0,05 М NaCl, затем 300 мл градиента концентрации NaCl от 0,05 до 0,8 М. Элюат собирали в 25 пробирок. Фракции 19-22, содержащие фермент, объединяли, наносили на колонку с 3,5 мл гидроксилапатита и промывали 10 мл 0,2 М NaCl. Фермент смывали 200 мл градиента концентрации К-фосфатного буфера, рН 7,2, от 0,01 до 0,25 М в 50 пробирок. Фракции 15-21 диализовали против буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,6, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,25 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА и 50% глицерина. Получили 7,5 мл препарата, который хранили при -20°. Результаты выделения суммированы в табл. 1.

 

Стадия выделения Объем фракции, мл Белок, мг Активность BmtI
общая, ед. удельная, ед/мг
Экстракт 35 280 900 000 3 200
Элюат с фосфоцеллюлозы P11 48 19 500 000 26 000
Элюат с гидроксилапатита 7,5 0,2 230 000 1 200 000

Таблица 1. Выделение рестриктазы BmtI из 10 г биомассы



Из 10 г клеток после их разрушения и хроматографической очистки на фосфоцеллюлозе Р11 и гидроксилапатите получали 7,5 мл препарата BmtI с активностью 30000 ед/мл. Выход фермента составил 26% при очистке по белку в 375 раз.
Оптимальные условия действия рестриктазы BmtI определяли в пяти стандартных буферных смесях при 37° и 55° (табл. 2). Фермент наиболее активен при 37° в буфере W (см. «Условия эксперимента»). В отличие от NheI и ее изошизомеров, рестриктаза BmtI малоактивна в буфере В при низкой ионной силе.

 

Температура, °С Активность BmtI в различных буферах, %
В G О W Y
37 12 50 75 100 50
55 12 12 6 6 12

Таблица 2 Относительная активность BmtI при расщеплении λ/HindIII ДНК при 37° и 55° в пяти стандартных буферах


Сайт ДНК, который узнает BmtI, идентифицировали по картине фрагментации ДНК фага λ [11] и аденовируса-2 [12], нуклеотидные последовательности которых известны. На рис. 1 видно, что BmtI узнает последовательность 5'-GCTAGC-3', как и ее прототип NheI [1].

 

Расщепление канонических ДНК лизатом клеток В. megaterium S2 для идентификации сайта ДНК, который узнает рестриктаза BmtI

 

 

Рис. 1. Расщепление канонических ДНК лизатом клеток В. megaterium S2 для идентификации сайта ДНК, который узнает рестриктаза BmtI:
1—лизат
2—лизат + ДНК фага λ
3 — ДНК аденовируса-2
М— маркер, λ-ДНК/BssT1I (StyI)

 


Связь каких именно нуклеотидов между собой расщепляет BmtI определяли с использованием дезоксирибонуклеотидного дуплекса, содержащего сайт узнавания рестриктазы (выделен):


5'-ATTCAGCAGCTGCTAGCATCGATATCG-3'
3'-TAAGTCGTCGACGATCGTAGCTATAGC-5'



Для идентификации на электрофореграмме 3'-концевых нуклеотидов дуплекс обрабатывали рестриктазой AsuNHI, расщепляющей 5'-G↑CTAGC-3', а также экзонуклеазой III из Е. coli.
На рис. 2 видно, что рестриктаза BmtI расщепляет цепи дуплекса по 5'-GCTAG↑C-3'. Таким образом, BmtI является гетерошизомером рестриктаз AsuNHI и NheI, которые расщепляют ДНК по последовательности 5'-G↑CTAGC-3'. Известен фермент AceII, расщепляющий ДНК аналогично BmtI, однако он коммерчески недоступен и его свойства не описаны в литературе. Мы полагаем, что обнаруженный нами фермент BmtI найдет применение в молекулярно-генетических исследованиях.

 

Определение нуклеотидов дуплекса известного состава (см. текст), связь между которыми гидролизует BmtI

 

Рис. 2. Определение нуклеотидов дуплекса известного состава (см. текст), связь между которыми гидролизует BmtI: а- верхняя цепь олигонуклеотидного дуплекса помечена 32Р по 5'-концу; б - нижняя цепь дуплекса помечена Р.
Использованные ферменты:
1 — BmtI,
2 — экзонуклеаза III;
3 — AsuNHI (узнает и расщепляет 5'-G^CTAGC-3'),
д — исходный дуплекс

 

 

 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДТТ — дитиотреитол;
БСА — бычий сывороточный альбумин;
PMSF — параметилсульфонилфторид

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Xu, S., Xiao, J. European Patent Office. ЕР 1096015, 2001.
  2. Dedkov, V. S., Degtyarev, S. Kh. // Biol. Chem. (F. Hoppe—Seyler). — 1998. — V. 379. — P. 573—574.
  3. Дедков В. С, Погребняк В.Б. Определение эндонуклеаз рестрикции в лизатах из отдельных колоний бактерий и измерение активности BamHI, PstI и MspI у бактерий, выращенных на питательном агаре и в бульоне. Тез. докл. 6-го рабочего совещания по программе «Плазмида». Пущино-на-Оке. — М., — 1981. — С. 50—51.
  4. Дедков B.C., Дегтярёв С.Х. // Приклад, биохим. — 1992.—Т. 28. —С. 309—313. (интернет-версия)
  5. Руководство к практическим занятиям по микробиологии // Под ред. Н. С. Егорова. — М., 1995.
  6. Краткий определитель бактерий Берги // Под ред. Дж. Хоулта. 9-е изд. Пер. с англ. канд. биол. наук С. Ш. Тер-Казарьяна / Под ред. чл.-корр. АН СССР Г.А. Заварзина. — М, 1980.
  7. Ehresmann, В.Н., Imbalt, P., Well, I.H. // Anal. Biochem. — 1973. —V. 54. —P. 454—463.
  8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. — М., 1984.
  9. Smith, И.О., Nathans, D. // J. Mol. Biol. —1973. —V. 81. — P. 419—423.
  10. Greene, P. J., Heyneker, H.L., Bolivar, F., et al. // Nucleic Acids Res. — 1978. — V. 5. — P. 2373—2380.
  11. Sanger, F., Coulson, A.R., Hong, G.F., et al. // J. Mol. Biol. — 1982. —V. 162. — P. 729—773.
  12. Roberts, R.J., Akisjarvi, G., Alestrom, P., et al. Adenovirus DNA. // Ed. W. Doerfler. - Boston, Lancaster: Martinus Nijhoff Publishing, 1986. —P. 151.