Главная  //  Научные статьи  //  Новые ферменты  //  Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina P2

Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina P2

 

Ю.П. Зернов, В.С. Дедков, Ю.А. Антонова, Н.А. Михненкова, С.Х. Дегтярев

Биотехнология, 2005, № 2, с. 38-43

 

Из природных изолятов нами был выделен продуцент термолабильной щелочной фосфатазы, идентифицированной как вид бактерии Alteromonas undina P2. Описан способ очистки фермента. Определены оптимальные условия действия щелочной фосфатазы: 0.1 М глицин-NaOH pH 9.5, 10 мМ MgCl2 и 0.1 мМ ZnCl2. Фермент наиболее активен при 30°C. При 6°C уровень активности щелочной фосфатазы превышает 50% от максимальной. Прогревание ферментного препарата в течение 20 мин при 65° приводит к полной необратимой инактивации фосфатазы.

 

Щелочные фосфатазы (EC 3.1.3.1) широко распространены в природе. Эти ферменты широкого субстратного спектра действия осуществляют каталитическое удаление фосфатной группы как со многих небольших органических молекул, так и с больших биомолекул, таких как ДНК и белки [1]. Щелочные фосфатазы обычно используются в молекулярной биологии и при проведении медицинских биохимических анализов. В молекулярной биологии фосфатазы применяются для удаления концевых фосфатных групп с молекул нуклеиновых кислот [2]. Наиболее существенными свойствами фосфатаз, для этих целей, являются высокая каталитическая активность и термолабильность ферментов, последнее позволяет легко инактивировать фосфатазную активность термической денатурацией без использования достаточно сложных процедур экстракции и осаждения [3].
Известно [4,5], что адаптация микроорганизмов к холодным условиям существования (так называемые психрофильные микроорганизмы) приводит к увеличению рыхлости и подвижности третичной структуры ферментов психрофилов, а это, в свою очередь, сказывается на термостабильности этих ферментов. В результате ферменты психрофилов оказываются зачастую гораздо более термолабильными, по сравнению с аналогичными ферментами мезофилов.
Целью данного исследования был поиск продуцента термолабильной щелочной фосфатазы. Поиск осуществлялся среди глубинных микроорганизмов в Авачинском заливе в районе острова Старичков.

 

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма изучали с использованием методик [6]. Определение штамма до вида проводили по определителю [7].
Для получения колоний, 50 мкл пробы морской воды растирали по поверхности питательного агара, дополненного солями, содержащимися в морской воде (г/л): агар (Copenhagen Pectin A/S, Дания) – 15; триптон (Organotechnie, Франция) - 10; дрожжевой экстракт (той же фирмы) – 5; тиамин - 0.01; NaCl - 27.5; MgCl2 – 5; MgSO4 – 2; CaCl2 - 0.5; KCl – 1; FeSO4 - 0.001; рН 7.2 - 7.7 [6]. После 2-х суток инкубации при 4°С выросло около 200 колоний, которые рассевали по 16 колоний на чашку, выращивали 20 ч при 24°C и использовали для определения фосфатаз и их термолабильности. Для этого 0.2-1 мг клеток с агара лизировали в 100 мкл 10 мМ трис-HCl (pH 7.7) с 0.2 мг/мл лизоцимом (Serva, Германия).
Для изучения влияния температуры на скорость роста A. undina P2, питательный бульон дополняли солями морской воды и засевали ночной бульонной культурой (выращенной со встряхиванием при 25°C). Засеянный бульон распределяли по 200 мл в 4-е качалочные колбы объёмом по 700 мл и встряхивали при 150 об/мин при 13°C, 25°C, 30°C и 37°C. Через определенные интервалы времени стерильно отбирали пробы культуры и измеряли оптическую плотность при 550 нм.
Биомассу A. undina P2 выращивали при 28°C (в 20 л бульона с солями морской воды) в ферментёре (New Brunswick Scientific, США) при перемешивании 200 об/мин и аэрации 14 л/мин до оптической плотности 8 ед. при 550 нм. Время выращивания обычно составляло 8 ч. Клетки осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 8000 об/мин на J-21 (Beckman,США) в роторе JA 10 при 4°C. В результате получали около 170 г биомассы, которую хранили при -20°C.
Выделение щелочной фосфатазы проводили при 4°C. 20 г полученной биомассы ресуспендировали в 80 мл буфера (20 мМ трис-HCl, pH7.6, 0.1 мМ ZnCl2, 0.05% лизоцим и 0.1% тритон Х-100), выдерживали в течение 1 ч и разрушали клетки с помощью ультразвукового дезинтегратора. Клеточный дебрис фракционировали, добавляя н-бутанол до 20% концентрации, выдерживали 30 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 40 мин. Водную фазу, содержащую фермент, диализовали против 2 л буфера: 20 мМ трис-HCl, pH7.6, 0.1 мМ ZnCl2 и пропускали через колонку (10х2см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 20 мМ трис-HCl, pH7.6, 0.1 мМ ZnCl2. Колонку промывали линейным градиентом концентрации NaCl (0-0.5 М) в том же буфере. Полученный фермент фракционировали гель-фильтрацией на колонке (100х1.6 см) с ультрагелем АсА 44, элюируя буфером: 0.8 М NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH7.6, 0.1 мМ ZnCl2 и 0.1% тритон Х-100. Фракции с фосфатазной активностью объединяли и концентрировали диализом против буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, pH7.6, 0.1 мМ ZnCl2 , 50% глицерин. Фермент хранили при -20°C.
Активность щелочной фосфатазы определяли по гидролизу 6 мМ p-нитрофенилфосфата при 30°C в 0.1 М глицин-NaOH-буфере, pH 9.5, содержащем 10 мМ MgCl2 и 0.1 мМ ZnCl2 в объеме 0.5 мл. После 15 мин инкубирования, реакцию останавливали добавлением 0.5 мл 2 М NaOH. Доводили объем пробы до 3 мл и измеряли оптическую плотность при 405 нм (ε405 = 18,5 мМ-1 см-1). За 1 ед. активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкмоль p-нитрофенилфосфата за 1 мин [8].
Для установления pH-оптимума активности фермента использовали следующие буферные системы: трис-HCl буфер (pH 7.6-9.0), глицин-NaOH буфер pH 9.0-10.5) в конечной концентрации 0.02-0.2 М.
Для определения примесных эндонуклеаз 5-10 ед. акт. фосфатазы инкубировали с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 30°C в буфере идентичном тому, который использовали для определения активности фермента. Объем реакционной смеси составлял 50 мкл. Отсутствие деградации фаговой ДНК контролировали с помощью гель-электрофореза в 1% агарозе.
Тестирование примесных экзонуклеаз проводили инкубированием 5-10 ед. акт. фосфатазы с 1 мкг фрагментов рестрикции ДНК фага лямбда эндонуклеазой Bme18 I в течение 1 ч при 30°C в буфере оптимальном для проявления активности фосфатазы. Объем реакционной смеси составлял 50 мкл. Отсутствие сдвига и размывания полос ДНК контролировали гель-электрофорезом в 1.4% агарозе.
При определении оптимума температуры реакцию проводили при 6, 23, 37, 45 и 55°C.
Для исследования термолабильности щелочной фосфатазы проводили инкубирование фермента в реакционной смеси в отсутствии субстрата в течение 20 мин при 6, 23, 37, 45, 55, 65°C. После чего температуру реакционных смесей доводили до 30°C, добавляли p-нитрофенилфосфат до 6 мМ концентрации и определяли остаточную ферментативную активность.
Для обнаружения влияния ионов металлов на активность фосфатазы варьировали концентрацию MgCl2 от 0 до 40 мМ, ZnCl2 от 0 до 10 мМ, NaCl от 0 до 200 мМ.



РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В поисках продуцента термолабильной щелочной фосфатазы было проанализировано около 200 колоний микроорганизмов, полученных нами из природных изолятов морской воды с глубины порядка 10 метров. Отбор проб осуществлялся в Авачинском заливе в районе острова Старичков, где температура в течение всего года не превышает + 10°C, т.е. существуют условия для обитания психрофильных микроорганизмов. В ходе исследований было выявлено три колонии, продуцирующие термолабильную щелочную фосфатазу. Дальнейшее изучение этих колоний показало, что по продуктивности щелочной фосфатазы, а также по морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам они оказались идентичными. Поэтому в последующем вся работа была проведена с использованием биомассы, полученной из одной из колоний.
Штамм-продуцент термолабильной фосфатазы имеет следующие характеристики. Клетки - подвижные палочки размером 0.7х(1-1.5) мкм, грамотрицательные, спор не образуют. Штамм - аэробный, каталазо- и оксидазоположительный, не восстанавливает нитрат в нитрит. Кислоту образует (слабо) из глюкозы, лактозы, галактозы, глицерина и маннита, но не из арабинозы, сахарозы, мальтозы, рамнозы, маннозы, ксилозы, сорбита, инозита, этанола и ацетата. Для роста как в бульоне, так и на питательном агаре были необходимы соли морской воды [6]. Добавление только 5 г/л NaCl и 1 г/л MgCl2 было недостаточно для роста колоний. Колонии на питательном агаре вырастали за 2 суток при 24°C и были круглые, 2-4 мм в диаметре, слабо конически-выпуклые, гладкие, блестящие, серовато-белые с прозрачными краями. Штамм идентифицировали по определителю [7] как вид бактерии Alteromonas undina P2.
Влияние температуры на скорость роста A. undina P2 изучали в бульоне при 13°C, 25°C, 30°C и 37°C. На рис. 1 видно, что культура не росла при 37°C, тогда как при более низких температурах плотность культуры достигала примерно 10 оп. ед. после 24 ч роста. Скорость роста при 13°C, 25°C и 30°C, была примерно одинаковой. Хотя в первые 4 часа культура быстрее росла при 30°C, но к 8 часам максимум оптической плотности был при 13°C. Вероятно, с увеличением плотности клеток начала сказываться недостаточная растворимость кислорода при повышении температуры. Кривая роста при 13°C наиболее соответствовала логарифмической, что свидетельствовало об оптимальности условий культивирования. Отсутствие роста при 37°C и активный рост при 13°C указывает на температуру экологической ниши культуры в океане. Штамм A. undina P2 явно психрофильный. С биохимической точки зрения можно ожидать, что его ферменты также имеют пониженный температурный оптимум и термолабильны.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper10_fig1.gif

 

 

 

Рис. 1. Выращивание Alteromonas undina P2 при различных температурах

 

 

 


Щелочную фосфатазу выделяли из клеточного экстракта обработкой 20% н-бутанолом с последующей хроматографической очисткой колоночной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрацией на колонке с ультрагелем АсА 44. Из 20 г биомассы при выходе 12% получали 8 тыс. ед.акт. щелочной фосфатазы с активностью 1 ед/мкл.
Препараты фермента не проявляли эндо- и экзонуклеазную активность, о чем свидетельствовало отсутствие деградации фаговой ДНК после инкубирования с фосфатазой. Так же не наблюдалось сдвига и размывания фрагментов рестрикции ДНК фага лямбда эндонуклеазой Bme18 I после выдерживания в присутствии фосфатазы. Это указывает на функциональную чистоту препаратов фермента и принципиальную возможность использования для дефосфорилирования ДНК.
Активность щелочной фосфатазы определяли по гидролизу p-нитрофенилфосфата. При определении зависимости активности фосфатазы от pH оценивалась ферментативная активность в различных буферных системах в диапазоне pH от 7.6 до 10.5. Фермент проявлял себя как типичная щелочная фосфатаза. С увеличением pH буфера активность фермента возрастала и достигала максимума в глицин-NaOH буфере при pH 9.5. Дальнейшее увеличение значений pH реакционной смеси приводило к некоторому снижению активности фосфатазы (рис.2). Понижение концентрации глицин-NaOH буфера с 0.1 М до 0.02 М приводило примерно к 50% процентному снижению скорости фосфатазной реакции. Это, видимо, обусловлено недостаточной емкостью буфера, поскольку увеличение ионной силы раствора за счет добавления NaCl до 0.2 М концентрации не оказывало существенного влияния. Варьирование концентрации NaCl от 0 до 0.2 М в 0.1 М глицин-NaOH буфере также оказывалось несущественным для фосфатазной активности, поскольку активность фермента изменялась не более, чем на 10%.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper10_fig2.gif

 

 

Рис. 2. Зависимость активности фосфатазы от pH.:

■ - трис-HCl буфер;

● - глицин-NaOH буфер

 

 

 

Для проявления фосфатазной активности необходимо присутствие ионов Mg2+ и Zn2+, поэтому была исследована зависимость активности фермента от концентрации этих ионов. В отсутствие в реакционной смеси ионов Mg2+ активность щелочной фосфатазы не обнаруживается, что указывает на абсолютную необходимость двухвалентных катионов Mg2+ для протекания ферментативной реакции. Оптимальная концентрация Mg2+ зависит от концентрации субстрата и, для достижения максимальной скорости, должна превышать последнюю. Так при проведении реакции с 6 мМ p-нитрофенилфосфатом максимальная скорость реакции достигалась уже при 10 мМ концентрации Mg2+ и практически не изменялась до 40 мМ концентрации. Отсутствие в реакционной смеси ионов Zn2+ оказывалось не столь драматичным и скорость реакции составляла порядка 60% от максимальной. Добавление Zn2+ в 0,01 мМ концентрации позволяло достичь максимальной скорости реакции и последняя оставалась постоянной вплоть до 1 мМ концентрации. Однако следует отметить, что 10 мМ концентрация Zn2+ приводила к полной инактивации щелочной фосфатазы.
Сильное ингибирующее действие на фосфатазную активность оказывало присутствие неорганического фосфата. Так в 10 мМ концентрации неорганический фосфат приводил к ингибированию ферментативной реакции более чем на 70%, а 30 мМ концентрация фосфата практически полностью ингибировала фермент. Увеличение концентрации Mg2+ до 40 мМ, а Zn2+ до 1мМ не уменьшали ингибирующего действия фосфата. Ингибирующее действие неорганического фосфата, видимо, обусловлено несколькими причинами. Во-первых, неорганический фосфат является продуктом реакции дефосфорилирования и может выступать в качестве конкурентного ингибитора фермента. Во-вторых, фосфат, связывая катионы Mg2+ , может ингибировать ферментативную активность из-за того, что мешает образованию субстрат - ферментного комплекса, который, как известно [1], осуществляется через магниевые мостики. И в-третьих, ионы Mg2+ и Zn2+ , видимо, выводятся неорганическим фосфатом из реакционной смеси в виде водонерастворимых солей, о чем свидетельствовало помутнение реакционной смеси и образование осадка.
Поскольку, как отмечалось ранее, щелочная фосфатаза обнаружена нами в психрофильном микроорганизме, было интересно определить зависимость активности фермента от температуры. Как видно из результатов, представленных на рис. 3, максимальная активность щелочной фосфатазы A. undina P2 наблюдалась при 30°С и резко убывала с увеличением температуры. Так при 55°С активность фермента составляла только 9% от максимальной. Вместе с тем, понижение температуры не оказывало такого влияния и при 6°С уровень активности превышал 50% от максимальной, что характерно для ферментов психрофилов [4]. Для сравнения на этом же рисунке представлена зависимость активности коммерческого препарата щелочной фосфатазы из кишечника теленка. Видно, что температурный оптимум для этой фосфатазы находится в районе 37°С и активность мало меняется при увеличении температуры до 55°С. Уменьшение температуры реакционной смеси до 6°С выражается в 5-ти кратном падении ферментативной активности.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper10_fig3.gif

 

 

Рис. 3. Зависимость активности фосфатаз от температуры

● - фосфатазы A. undina P2

■ - фосфатаза из кишечника теленка

 



Инкубирование щелочной фосфатазы A. undina P2 в реакционной смеси в отсутствии субстрата в течение 20 мин при различных температурах, представленное на рис. 4, демонстрирует высокую термолабильность фермента. Видно, что в интервале 30-40°С происходит резкая инактивация фермента.
Прогревание ферментного препарата щелочной фосфатазы A. undina P2 в течение 20 мин при 65°С (как в отсутствии субстрата, так и в его присутствии) приводило к полной необратимой инактивации фосфатазы. Для сравнения представлена зависимость термостабильности фосфатазы из кишечника теленка. Видно, что только при 65°С наблюдается некотарая инактивация фермента.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper10_fig4.gif

 

 

Рис. 4. Термостабильность фосфатаз при различных температурах:

● - фосфатазы A. undina P2

■ - фосфатаза из кишечника теленка

 

 



Таким образом, из полученных данных следует, что щелочная фосфатаза, выделенная из морского психрофильного микроорганизма Alteromonas undina P2, является термолабильным ферментом и может быть использована в молекулярной биологии для удаления концевых фосфатных групп с молекул нуклеиновых кислот.
Выражаем благодарность Н. Санамян за техническое содействие в отборе глубинных проб микроорганизмов.



ЛИТЕРАТУРА

  1. McComb, R.B., et al. Alkaline phosphatase. New York: Plenum Press, 1979.
  2. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
  3. Kobori, H., et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1984. - V. 81. - P. 6691-6695.
  4. Feller, G., et al. //Comp. Biochem. Physiol. - 1997. - V. 118A. - P. 495-499.
  5. Cavicchioli, R., et al. //Current Opinion in Biotechnology - 2002. - V. 13. - P. 253-261.
  6. Методы общей бактериологии. / Под. ред. Ф. Герхардта и др.: В 3 томах: Пер. с англ. под ред. чл. корр. АН СССР Е. Н. Кондратьевой и проф. Л. В. Калакуцкого, - М., 1984.
  7. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Хоулта Дж. и др.: 9-е издание в 2-х томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина, - М., 1997.
  8. Olsen, R.L., et al. // Comp. Biochem. Physiol. - 1991. - V. 99B. - P. 755-761.