Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico

 

В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2007, 3, №4, с. 19-27.

 

На основе ранее предложенного метода рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico рассчитаны диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК мыши при ее расщеплении по 18 нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Проведен анализ имеющихся в базе данных нуклеотидных последовательностей LINE1 повторов мыши и фрагментов ДНК, образующихся при расщеплении этих повторов. Установлено, что абсолютное большинство пиков на диаграммах расщепления хромосомной ДНК соответствуют аналогичным пикам, образуемым при расщеплении множества LINE1 повторов ДНК мыши по тем же нуклеотидным последовательностям. Получены экспериментальные картины гидролиза ДНК мыши соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Проведено сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов и полученных картин гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции. Показано, что при анализе препаратов ДНК с помощью электрофореза в геле визуализируются только продукты расщепления LINE1-повторов и γ-сателлитной ДНК мыши. Проделаны эксперименты по гидролизу хромосомной ДНК мыши 5-метилцитозин-зависимыми сайт-специфическими эндонуклеазами BlsI, GlaI и GluI.

 

В настоящее время первичная структура эухроматиновой части генома мыши определена более чем на 96% [1], что позволяет анализировать структуру ДНК in silico. Ранее нами был предложен метод проведения рестрикционного анализа ДНК млекопитающих in silico путем построения диаграмм распределения фрагментов, получаемых при расщеплении хромосомной ДНК по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции (ЭР) [2]. Для ряда последовательностей ДНК (5’-CCWGG-3’, 5’-GATC-3’, 5’-GGCC-3’ и 5’-CCGG-3’) были получены такие диаграммы расщепления хромосомной ДНК крысы, мыши и человека и проведено сравнение теоретических расчетов с экспериментальными результатами по гидролизу хромосомных ДНК эндонуклеазами рестрикции Bst2UI, Kzo9I, HaeIII и MspI, имеющими эти сайты узнавания. В дальнейшем нами был проведен сравнительный рестрикционный анализ расщепления геномной ДНК крысы [3] и человека [4] и показано хорошее соответствие картин рестрикции in vitro и in silico.
Целью настоящей работы явилось получение диаграмм распределения фрагментов при расщеплении хромосомной ДНК мыши по 18 сайтам узнавания, включая 4-х, 5-ти и 6-тинуклеотидные последовательности и сравнение полученных данных с результатами гидролиза ДНК соответствующими эндонуклеазами рестрикции.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

Хромосомная ДНК мыши

В экспериментах использовали мышей-самцов линии A/He в возрасте 5-6 месяцев разведения вивария ИЦиГ СО РАН. Геномная ДНК из печени животных выделялась, как описано ранее [3].

 

Гидролиз хромосомной ДНК

В работе использовали следующие сайт-специфические эндонуклеазы производства НПО “СибЭнзим” (в скобках указан сайт узнавания соответствующей эндонуклеазы):
AcsI (5’-RAATTY-3’), AspA2I (5’-CCTAGG-3’), AspS9I (5’-GGNCC-3’), BglII (5’-AGATCT-3’), BlsI (5’-GmCNGmC-3’), Bme18I (5’-GGWCC-3’), Bse3DI (5’-GCAATG-3’и 5’-CATTGC-3’), Bsp19I (5’-CCATGG-3’), Bst2UI (5’-CCWGG-3’), BstFNI (5’-CGCG-3’), BstSCI (5’-CCNGG-3’), BstX2I (5’-RGATCY-3’), EcoRI (5’-GAATTC-3’), EcoRV (5’-GATATC-3’), ) Fsp4HI (5’-GCNGC-3’), GlaI (5’-GmCGmC-3’), GluI (5’-GmCNGmC-3’), HpaII (5’-CCGG-3’), HspAI (5’-GCGC-3’), MspI (5’-CCGG-3’), PspN4I (5’-GGNNCC-3’), RsaI (5’-GTAC-3’), Sse9I (5’-AATT-3’), SspI (5’-AATATT-3’) и TaqI (5’-TCGA-3’).
ДНК в количестве 6 мкг расщепляли в 40 мкл реакционной смеси в рекомендуемых производителем SE-буферах для рестрикции ДНК при оптимальных температурах в течение 3 ч.

 

Электрофорез

Для выявления фрагментов ДНК длиной от 40 до 500 п. н. использовали электрофорез в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) в камере Hoefer SE 600/SE 660 (Amersham USA). На гель наносили 6 мкг гидролизованной ДНК на дорожку. Для выявления фрагментов в диапазоне 200-2000 п.н. использовали 1,5% агарозу “Low melting point” («Sigma», USA). На гель наносили 3 мкг гидролизованной ДНК на дорожку.
Для выявления фрагментов ДНК в диапазоне 500-20000 п.н. применяли электрофорез в 1%-й агарозе “Type I-A, Low EEO” (АГ), “Sigma”, USA), на гель наносили 3 мкг гидролизованной ДНК на дорожку.
Для разделения фрагментов в диапазоне от 10 до 50 т.п.н. использовали импульсный электрофорез в 1%-м агарозном геле [5]. На гель наносили 1 мкг ДНК. Напряженность поля при прямом импульсе составляла 6 В/см при длительности импульса 1,5 сек. Напряженность поля при обратном импульсе составляла 6 В/см, а длительность импульса менялась в последовательности 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 сек.
В качестве маркёра молекулярных весов ДНК использовали 50 kb ДНК маркер, 1 kb ДНК-маркер и pUC19/MspI ДНК маркер производства НПО “СибЭнзим”.
Во всех случаях для электрофореза применяли трис-ацетатный буфер (40 мМ Трис-ацетат, pH 8,0; 1 мМ ЭДТА). После проведения электрофореза ДНК визуализировали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете.

 

Данные о нуклеотидной последовательности генома мыши

Последовательность ДНК мыши была получена с ресурса ftp://ftp.ensembl.org/pub/ (версия от 2 июня 2006 года).
Нуклеотидная последовательность основного мономерного фрагмента γ-сателлитной ДНК мыши взята из [6].
Последовательности LINE1-повторов были извлечены из базы данных геномной ДНК мыши с помощью сервиса Table Browser на сайте (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables) [8]. Полученная выборка LINE1-повторов включала в себя 854172 последовательности с общей длиной ~510 млн. п.н.

 

Программное обеспечение

Построение диаграмм распределения фрагментов, получаемых при расщеплении ДНК по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции, в виде зависимости суммарной массы фрагментов фиксированной длины, выраженной в парах оснований, от длины фрагментов (в парах нуклеотидов) проводили по методике, описанной ранее [2].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Анализ диаграмм распределения фрагментов ДНК

Ранее нами были получены диаграммы распределения фрагментов при расщеплении хромосомной ДНК мыши по сайтам узнавания рестриктаз HaeIII (5’-GGCC-3’), MspI (5’-CCGG-3’), Kzo9I (5’-GATC-3’) и Bst2UI (5’-CCWGG-3’) и показано хорошее соответствие между расчетными данными и результатами экспериментов по гидролизу ДНК этими ферментами [2]. В настоящей работе мы провели построение диаграмм распределения фрагментов, получаемых при расщеплении хромосомной ДНК мыши по более широкому спектру сайтов узнавания, включая и шестинуклеотидные последовательности. В соответствии с предложенным ранее методом [2] диаграммы распределения строились с использованием арктангенсоидной шкалы, имитирующей разделение получаемых фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Были отобраны только те диаграммы расщепления, которые содержат пики ДНК фрагментов более 5,5 млн пар оснований. Как было показано в предыдущей работе [2], именно такие пики визуализируются в эксперименте при анализе продуктов расщепления ДНК электрофорезом в агарозном геле. При этом на визуализацию пиковых фрагментов ДНК может оказывать влияние фон, образованный расщеплением основной массы ДНК и способный частично маскировать эти фрагменты [2].
Всего нами было проанализировано расщепление по 18 сайтам узнавания ЭР, приводящее к образованию ДНК фрагментов с высоким значением пиков.
На рис.1 приведены диаграммы распределения фрагментов геномной ДНК мыши, полученные для этих последовательностей узнавания.

Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов геномной ДНК и электрофореграмм Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов геномной ДНК и электрофореграмм Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов геномной ДНК и электрофореграмм

Рис. 1. Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов геномной ДНК и электрофореграмм, полученных при гидролизе ДНК соответствующими эндонуклеазами рестрикции.
Электрофорез продуктов гидролиза ДНК ферментами AspA2I, BstV2I, BglII, Bse3DI, Bsp19I, EcoRI, EcoRV, NdeI, PstI проводился в 1% агарозном геле,
ферментами PspN4I, SspI, AspS9I, Bme18I, BstSCI, BstDEI, BstX2I, Fsp4HI) - в 1,5% -ном агарозном геле и RsaI - в 8% ПААГ.
Название фермента указано над фотографией геля.
М – 1 kb маркёр молекулярных весов ДНК.
На диаграммах числами указаны размеры пиковых фрагментов, образуемых при сайт-специфическом расщеплении хромосомной ДНК мыши (п.н.).
Высота пика соответствует количеству нуклеотидов во всех фрагментах данной длины ( п.н.)

 

Максимальные значения высоты пиков (более 10 млн. п.н.) наблюдаются при расщеплении ДНК по сайтам узнавания ферментов Bse3DI (фрагменты длиной 1059 и 2590 п.н.), Bst2UI и BstSCI (фрагмент длиной 1826 п.н.), Fsp4HI (фрагменты длиной 695 и 1613 п.н.), PctI (фрагмент длиной 2859 п.н.) и EcoRI (фрагмент длиной 1373 п.н.). Визуализация последнего фрагмента была описана в литературе ранее [7]. Полосы ДНК, соответствующие этим фрагментам, хорошо видны на электрофореграммах разделения продуктов гидролиза ДНК данными рестриктазами, которые приведены на рис.1 над соответствующими диаграммами распределения.
Остальные фрагменты меньшей интенсивности, отмеченные на диаграммах на рис.1, также представлены в виде полос на соответствующих фотографиях гелей при гидролизе ДНК ферментами AspA2I (1273, 3343-3344 и 4613 п.н.), BglII (876 п.н.), Bsp19I (3253 п.н.), EcoRV (1883 п.н.), Fsp4HI (583 и 1035) и PspN4I (444, 508, 716 и 1721 п.н.). При гидролизе ДНК ферментом Bme18I на электрофореграмме видны фрагмент 1619 п.н. и дубль фрагментов 809 и 818 п.н. Фрагмент длиной 708 п.н., по-видимому, сливается с фрагментом γ-сателлитной ДНК, имеющем длину около 705 п.н [6].
Электрофореграммы гидролиза ДНК остальными ферментами имеют значительные участки фоновых фрагментов ДНК, которые маскируют полосы ДНК, соответствующие расчетным данным. В частности, при гидролизе ДНК ферментами Bst2UI и BstSCI маскируются все полосы ДНК, кроме соответствующих фрагментам 1511 и 1826 п.н. При расщеплении ДНК ферментом BstX2I на геле видны полосы, соответствующие фрагментам ДНК длиной 203, 397, 508, 514 и 713 п.о., но не видно фрагмента длиной 1856 п.н., который, по-видимому, маскируется фоном. Аналогичная картина наблюдается с ферментом RsaI: на электрофореграмме в ПААГ не визуализируются пиковые фрагменты длиной больше 503 п.н.
Как было показано нами ранее [3], явление кластеризации близко лежащих фрагментов ДНК позволяет в ряде случаев визуализировать пиковые фрагменты с высотой менее 5,5 млн. п.н. На рис.1 приведена картина гидролиза ДНК ферментом SspI, на которой видна полоса ДНК, соответствующая фрагменту длиной 1037 п.н. Однако данный фрагмент в диаграмме расщепления имеет пиковое значение только 3,7 млн. п.н., что ниже вышеуказанной критической высоты пика. Визуализация соответствующей полосы на электрофореграмме связана с наличием сразу нескольких фрагментов, близких по размерам, но существенно меньшей интенсивности, что хорошо видно на более детальной диаграмме распределения фрагментов хромосомной ДНК (рис. 2).

Диаграмма распределения фрагментов, получаемых при расщеплении геномной ДНК

 

Рис. 2. Диаграмма распределения фрагментов, получаемых при расщеплении геномной ДНК мыши по последовательности 5’-AATATT-3’.
Обозначения на диаграмме:
ось X – длины фрагментов, образуемых при сайт-специфическом расщеплении хромосомной ДНК мыши (п.н.)
ось Y – величины пиков, образуемых при сайт-специфическом расщеплении хромосомной ДНК мыши (п.н.)

 

Как видно из рис. 1, в случае некоторых ЭР (AspS9I, Bme18I, Bst2UI, BstSCI и SspI) на электрофореграммах хорошо видны полосы ДНК, которые не соответствуют никаким пиковым фрагментам, представленным на соответствующих диаграммах и, видимо, являются продуктами гидролиза γ-сателлитной ДНК мыши [6], не представленной в базе данных геномной ДНК [1]. Как видно из рис.1, яркость этих полос ДНК на фотографии гелей существенно выше светимости фрагментов, получаемых при расщеплении геномной ДНК. Это связано с высоким количеством повторов в сателлитной ДНК и более высокой долей этой ДНК в суммарном препарате ДНК мыши по сравнению с хромосомной ДНК крысы и человека [3,4]. По некоторым оценкам доля γ-сателлитной ДНК мыши составляет примерно 10% от общего количества хромосомной ДНК [6].
При гидролизе хромосомной ДНК ферментами AspS9I, Bme18I, BstSCI и Bst2UI, происходит выщепление фрагмента, электрофоретическая подвижность которого соответствует длине так называемого основного фрагмента γ-сателлитной ДНК мыши длиной 234 п.н. [6] (рис. 3). Сайты узнавания этих ферментов представлены в нуклеотидной последовательности основного мономерного фрагмента в позициях 1, 1, 4 и 4, соответственно, и гидролиз тандемных повторов сателлитной ДНК по этим позициям приводит к образованию фрагмента 234 п.о. [6]. Расщепления γ-сателлитной ДНК мыши с образованием такого фрагмента наблюдается также при гидролизе ферментами BstF5I (5’-GGATG-3’, позиция 166), FatI (5’-CATG-3’, позиция 150), Sse9I (5’-AATT-3‘, позиция 98), AcsI (5’-RAATTY-3’, позиция 97). Кроме того, как было описано в литературе [6], в результате гидролиза сателлитной ДНК образуются также фрагменты кратной длины (468 п.н., 702 п.н. и т.д), состоящие из двух или нескольких мономерных фрагментов. На электрофореграмме на рис.3 практически на всех дорожках видны такие димеры, тримеры и даже тетрамеры основного фрагмента сателлитной ДНК. Наличие мультимерных фрагментов сателлитной ДНК очевидно связано с высокой вариабельностью первичной структуры этой ДНК и изменением нуклеотидной последовательности в сайтах узнавания рестриктаз. Из-за этого не в каждом повторе происходит гидролиз ДНК по соответствующим позициям и, как результат, образуются димеры, тримеры и т.д. При этом для разных ферментов наблюдается различное распределение мультимерных фрагментов по длинам, что, видимо, связано с размерами сайта узнавания фермента. В частности, фермент AcsI имеет расширенный сайт узнавания фермента Sse9I и количество тримеров и тетрамеров, наблюдаемое в случае гидролиза ДНК ферментом AcsI, больше, а мономера меньше, чем в случае расщепления ДНК ферментом Sse9I. На картине гидролиза ДНК ферментом SspI, который узнает шестинуклеотидный невырожденный сайт узнавания, видны фрагменты, соответствующие по длине димеру (468 п.н.), тримеру (702 п.н.), тетрамеру ( 936 п.н.) и даже пентамеру (1170 п.н.), но почти не видна полоса, соответствующая основному мономерному фрагменту γ-сателлитной ДНК.

 

Гидролиз ДНК мыши эндонуклеазами рестрикции

 

 

Рис. 3. Гидролиз ДНК мыши эндонуклеазами рестрикции.
Название используемых ферментов указано над дорожкой геля.
Электрофорез в 1,5%-й агарозе в ТАЕ-буфере.
М – 1 kb маркёр молекулярных весов ДНК

 

 


Таким образом, часть фрагментов ДНК, представленных на электрофореграммах более яркими полосами, образуются в результате расщеплением γ-сателлитной ДНК мыши.
Меньшая по интенсивности, но значительно более разнообразная часть рестрикционных фрагментов получается при расщеплении эухроматиновой части ДНК мыши, состоящей из рассеянных повторов. Короткие и длинные диспергированные повторы занимают у мыши 39% генома [10]. Наиболее многочисленными повторами у мыши являются длинные диспергированные повторы (LINE), основная часть которых представлена семейством L1-повторов [1], обнаруженных к настоящему времени в большинстве отрядов млекопитающих [9]. Изучаемая нами выборка LINE1-повторов включала в себя более 854 тысяч последовательностей с общей длиной более 500 млн. п.н., что составляет приблизительно 1/5 часть генома мыши [1]. Полноразмерные LINE1-повторы имеют длину 6-7 т.п.н., однако большинство повторов этого класса представлены укороченными копиями [11] и лишь 5713 имели длину более 6 т.п.н. Ввиду относительно большой длины LINE1 повторов, размеры фрагментов ДНК, образованных при их гидролизе эндонуклеазами рестрикции, существенно различаются.
Отдельные семейства коротких рассеянных повторов (SINE) составляют у мыши в несколько раз меньшую часть генома по сравнению с L1-повторами [1]. В связи с тем, что в выбранных нами условиях анализа продукты расщепления SINE повторов не визуализируются, мы не рассматривали гидролиз SINE повторов в данной работе.
Мы провели сравнение полученных выше диаграмм распределения фрагментов геномной ДНК (см. рис.1) и диаграмм, рассчитанных для выборки L1-повторов (см «Материалы и методы»). На рис.4 приведены оба типа диаграмм для сайтов узнавания рестриктаз BglII и AspS9I. Как видно из рисунка, все пиковые фрагменты, присутствующие в диаграммах расщепления геномной ДНК также представлены на диаграммах расщепления L1-повторов.
В большинстве случаев величины пиков фрагментов ДНК, рассчитанная для геномной ДНК, не отличаются от величин пиков, рассчитанной для расщепления выборки L1-повторов (с учетом фона, получаемого при расщеплении геномной ДНК). Так, например, как видно из рисунка 4, высота пикового фрагмента длиной 876 п.н., полученного при расщеплении ДНК по сайту узнавания ЭР BglII (5’-AGATCT-3’) практически совпадает в этих двух диаграммах.

 

Сайт узнавания BglII (5’-AGATCT-3’)
А)
Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов, получаемых после расщепления  геномной ДНК  и выборки LINE1-повторов
Б)
Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов, получаемых после расщепления  геномной ДНК  и выборки LINE1-повторов
Сайт узнавания AspS9I (5’-GGNCC-3’)
В)
Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов, получаемых после расщепления  геномной ДНК  и выборки LINE1-повторов
Г)
Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов, получаемых после расщепления  геномной ДНК  и выборки LINE1-повторов

Рис. 4. Сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов, получаемых после расщепления геномной ДНК (А, В) и выборки LINE1-повторов (Б, Г).
Обозначения на диаграммах:
ось X – длины фрагментов, образуемых при сайт-специфическом расщеплении геномной ДНК или L1-повторов мыши (п.н.) ферментами BglII (А, Б) и AspS9I (В, Г).
ось Y – величины пиков, образуемых при сайт-специфическом расщеплении геномной ДНК или L1-повторов мыши (п.н.).



Однако в ряде случаев высоты пиковых фрагментов, рассчитанных для L1-повторов, существенно меньше по сравнению со значениями высоты пиковых фрагментов на диаграммах, рассчитанных для геномной ДНК. Так, например, при расщеплении по сайту GGNCC (сайт узнавания AspS9I) фрагмент длиной 708 п.н. имеет значение 8,0 млн. п.н. на диаграмме расщепления геномной ДНК и только 3,6 млн. п.н. на диаграмме расщепления L1-повторов (рис. 4). Данное расхождение может быть следствием недостаточной представительности выборки L1-повторов.

 

ВЛИЯНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ НА ГИДРОЛИЗ ХРОМОСОМНОЙ ДНК САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИМИ ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ

Одной из основных причин, влияющих на эффективность гидролиза хромосомной ДНК млекопитающих рядом эндонуклеаз рестрикции, является блокирование расщепления ДНК из-за метилирования цитозина в динуклеотиде CG. В соматических клетках млекопитающих уровень метилирования составляет примерно 70-80% всех CG-пар [12]. Поэтому гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции, которые содержат в сайте узнавания CG-последовательность, может быть ограничен. Кроме того, как показано для геномов ряда млекопитающих и, в том числе, мыши, доля CG-динуклеотидов в ДНК примерно в 5 раз ниже по сравнению с частотой встречаемости других динуклеотидных последовательностей, состоящих только из нуклеотидов G и C [13,14]. Поэтому другой причиной, обусловливающей небольшую глубину гидролиза ДНК такими рестриктазами, является более низкая частота встречаемости сайтов узнавания, содержащих CG-динуклеотид [3].
На рис. 5 показаны результаты расщепления хромосомной ДНК мыши эндонуклеазами рестрикции, у которых в сайте узнавания есть последовательность CG. На рис. 5А приведена электрофореграмма разделения продуктов гидролиза ДНК, полученная в 1%-м агарозном геле при постоянном напряжении, а на 5Б – при переменном напряжении электрического поля (импульсный электрофорез).

 

Гидролиз ДНК мыши эндонуклеазами рестрикции, в сайте узнавания которых есть CG динуклеотид, и метилзависимыми сайт-специфичными эндонуклеазами

 

Рис. 5. Гидролиз ДНК мыши эндонуклеазами рестрикции, в сайте узнавания которых есть CG динуклеотид, и метилзависимыми сайт-специфичными эндонуклеазами. Название фермента указано над дорожкой на фотографии геля.
А – электрофорез в АГ при постоянном напряжении электрического поля (М - 1 kb маркёр молекулярных весов ДНК)
Б – импульсный электрофорез в АГ (М - 50 kb маркёр молекулярных весов ДНК)
И - исходная ДНК

 

 


Как видно из рис. 5А, HpaII совершенно незначительно расщепляет ДНК, хотя MspI, (другой фермент с этим же сайтом узнавания CCGG, но не чувствительный к CG-метилированию) эффективно расщепляет ДНК мыши. Также, метилированием CG-динуклеотидов в геномной ДНК, можно объяснить незначительный гидролиз ДНК ферментами BstFNI (сайт узнавания CGCG) и HspAI (сайт узнавания GCGC).
Использование импульсного гель-электрофореза позволяет разделять фрагменты ДНК в диапазоне до 50000 п.н. [5]. В этом случае, как видно из рис. 5Б, гидролиз хромосомной ДНК мыши рестриктазами HpaII и HspAI заметен существенно лучше. При расщеплении этими рестриктазами большинство получаемых фрагментов ДНК имеет размеры в диапазоне от 10 до 50 т.п.н. В случае ЭР BstFNI расщепление хромосомной ДНК даже при использовании импульсного электрофореза практически не визуализируется. Причина этого, видимо, заключается в том, что в отличие от HpaII и HspAI, в сайте узнавания BstFNI содержится сразу два динуклеотида CG, что обусловливает более низкую частоту сайтов узнавания BstFNI по сравнению с последовательностями узнавания HpaII и HspAI. Кроме того, из-за наличия двух CG-динуклеотидов, доля сайтов узнавания BstFNI, содержащих метилированный цитозин существенно выше, по сравнению с сайтами узнавания HpaII и HspAI.
В последние годы появился новый инструмент для анализа статуса метилирования ДНК – сайт-специфичные метилзависимые эндонуклеазы, которые расщепляют ДНК только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозинов [15], [16], [17], [18]. .
К таким ферментам относятся GlaI, эффективно гидролизующий целый ряд различных метилированных четырехнуклеотидных последовательностей ДНК, содержащих от 2-х до 4-х 5-метилцитозинов [16], [19].
Кроме того, описаны метилспецифичные ферменты, которые эффективно гидролизуют последовательность ДНК GCNGC c двумя - четырьмя 5-метилцитозинами (BlsI [17]) или только с четырьмя 5-метилцитозинами (GluI [18]). Результаты расщепления этими тремя ферментами ДНК мыши приведены на рис. 4. На рис. 4А приведена электрофореграмма анализа продуктов гидролиза, полученная в стандартных условиях разделения фрагментов ДНК. Как видно из этого рисунка, эффективный гидролиз хромосомной ДНК наблюдается только в случае GlaI, при этом глубина гидролиза ДНК близка к таковой для ферментов MspI и TaqI.
В случае BlsI и GluI гидролиз на приведённой электрофореграмме практически не визуализируется, что связано с низкой частотой встречаемости метилированных сайтов узнавания этих ферментов на хромосомной ДНК. Однако при использовании импульсного электрофореза (рис. 4Б) видно, что BlsI, в отличие от GluI, все-таки гидролизует хромосомную ДНК с образованием высокомолекулярных фрагментов.
Фермент BlsI способен расщеплять метилированные последовательности СGCGGC или GCСGCG, представляющие собой два варианта расширенного на один нуклеотид сайта узнавания (последний подчеркнут). При этом в сайте узнавания появляется два метилированных цитозина. GluI расщепляет последовательность GCNGC только при наличии четырех цитозинов и, соответственно, не способен гидролизовать подобные сайты. Таким образом, в отличие от BlsI, гидролиз ДНК ферментом GluI невозможен из-за недостатка 5-метилцитозинов в сайте узнавания.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проведен рестрикционный анализ ДНК мыши in silico для широкого спектра последовательностей узнавания, а также получены экспериментальные картины расщепления ДНК соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Показано, что экспериментально наблюдаемые фрагменты ДНК являются продуктами расщепления LINE1-повторов и γ-сателлитной ДНК мыши. Теоретически показано существование более чем пятидесяти пиковых значений фрагментов (или кластеров фрагментов) ДНК, получаемых при расщеплении геномной ДНК мыши по 18 нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Установлено, что получаемые диаграммы расщепления геномной ДНК мыши в целом соответствуют диаграммам расщепления выборки соответствующих LINE1-повторов, однако для ряда сайтов наблюдается несоответствие величины пиков, получаемых во втором случае. Приведенное в работе сравнение рассчитанных диаграмм распределения фрагментов ДНК мыши и полученных картин гидролиза ДНК соответствующими ферментами рестрикции показывает хорошее соответствие теоретических и экспериментальных данных
В ходе электрофоретического анализа продуктов гидролиза хромосомной ДНК мыши метилзависимыми эндонуклеазами установлено, что наблюдается существенное расщепление ДНК ферментом GlaI, значительно более слабое ферментом BlsI, а GluI практически не расщепляет ДНК.

Авторы благодарят к.б.н. Каледина В.И. за помощь в работе с животными и к.б.н. Васильева Г.В. за помощь в выделении ДНК.

 

ЛИТЕРАТУРА

 

  1. Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome // Nature. – 2002. – Vol. 420. – P. 520–562.
  2. Абдурашитов М. А., Томилов В. Н., Чернухин В. А., Гончар Д. А., Дегтярёв С. Х. Метод рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2006. – Т. 2 №3. – С. 29-38. (Онлайн-версия )
  3. Чернухин В.А., Абдурашитов М.А., Томилов В.Н., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2007. – Т. 2. – № 3. – С. 39–46. (Онлайн-версия )
  4. Абдурашитов М.А., Чернухин В.А., Томилов В.Н., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Рестрикционный анализ повторяющихся последовательностей ДНК человека // Медицинская генетика. – 2007. – Т. 6. – № 8. – С. 29–36. (Онлайн-версия )
  5. Зернов Ю.П., Перминова Л.В., Пустошилова Н.М. Разделение двунитиевых молекул ДНК электрофорезом в агарозе с использованием пульсирующего поля // Известия СО АН СССР, серия биологическая. – 1989. – Вып. 2. – С. 104–107.
  6. Horz W., Altenburger W. Nucleotide sequence of mouse satellite DNA // Nucleic Acids Res. – 1981. – Vol. 9. – P. 683–696.
  7. Cheng S.-M., Schildkraut C.L. A family of moderately repetitive sequences in mouse DNA // Nucleic Acids Res. – 1980. – Vol. 8. – P. 4075–4090.
  8. Karolchik D., Hinrichs A.S., Furey T.S., Roskin K.M., Sugnet C.W., Haussler D., Kent W.J. The UCSC Table Browser data retrieval tool // Nucleic Acids Res. – 2004. – Vol. 32 (Suppl. 1). – D493–D496.
  9. Hutchison C.A. III, Hardies S.C., Loeb D.D., Shehee W.R., Edgell M.H. LINEs and related retroposons: Long interspersed repeated sequences in the eukariotic genome / In: Mobile DNA (Eds. Berg D.E, Howe M.M.). – American Society for Microbiology, Washington. – 1989. – P. 593–617.
  10. Shonbach Ch. From masking repeats to identifying to functional repeats in the mouse transcriptome // Briefings in bioinformatics. – 2004. – Vol. 5. – № 2. – P. 107-117.
  11. Wincker P., Jubier-Maurin V., Roizes G. Unrelated sequences at 5’-end of the mouse LINE-1 repeated elements define two distinct subfamilies // Nucleic Acids Res. – 1987. – Vol. 15. – P. 8593–8606.
  12. Ehrlich M., Gama S.M., Huang L.H., Midgett R.M., Kuo K.C., McCune R.A., Gehrke C. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues or cells // Nucleic Acids Res. – 1982. – Vol. 10. – P. 2709–2721.
  13. Ohno S. Universal rule for coding sequence construction: TA/CG deficiency-TG/CT excess // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1988. – Vol. 85. – P. 9630–9634.
  14. Yomo T., Ohno S. Concordant evolution of coding and noncoding regions of DNA made possible by the universal rule of TA/CG deficiency-TG/CT excess // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1989. – Vol. 86. – P. 8452–8456.
  15. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнаёт метилированную последовательность 5’-GCGC-3’ // Биотехнология. – 2006. – № 4. – С. 31–35. (Онлайн-версия )
  16. Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Дегтярев С.Х. Зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов в узнаваемой последовательности 5’-GCGC-3’ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2006. – Т. 2. – № 1. – С. 30–39. (Онлайн-версия )
  17. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнаёт последовательности ДНК 5’-G(5mC)NGC-3’ и расщепляет её с образованием 3’-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2007. – Т.3. – № 1. – С. 28-33. (Онлайн-версия )
  18. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая эндонклеаза GluI узнаёт метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN(5mC)G-5’ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2007. – Т. 3. – № 2. – С. 13-17. (Онлайн-версия )
  19. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.Kh. Substrate specificity on new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biology. – 2008. – 9:7. (Онлайн-версия )