Главная  //  Научные статьи  //  Исследования геномной ДНК  //  Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico

Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico

 

В.А. Чернухин, М.А. Абдурашитов, В.Н. Томилов, Д.А. Гончар, С.Х. Дегтярев

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 2006, т. 2, №3, с. 39-46

 

На основе ранее предложенного метода рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico рассчитаны диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК крысы при ее расщеплении по более чем 25 нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. При проведении рестрикционного анализа in vitro получены картины электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях продуктов гидролиза ДНК крысы всеми этими ферментами. Проведено сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов и экспериментально полученных данных по гидролизу ДНК соответствующими эндонуклеазами рестрикции. 

 

В настоящее время первичная структура ДНК крысы определена более чем на 90% [1] и эти данные постоянно обновляются. В предыдущей работе нами был предложен несложный метод проведения рестрикционного анализа ДНК млекопитающих in silico путем построения диаграмм распределения фрагментов, получаемых при расщеплении хромосомной ДНК по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции. Для последовательностей ДНК 5'-CCWGG-3', 5'-GATC-3', 5'-GGCC-3' и 5'-CCGG-3' были получены такие диаграммы расщепления хромосомной ДНК крысы, мыши и человека. Сравнение теоретических расчетов с экспериментальными результатами по гидролизу хромосомных ДНК эндонуклеазами рестрикции Bst2UI, Kzo9I, HaeIII и MspI, имеющими эти сайты узнавания, показало хорошее соответствие картин рестрикции in vitro и in silico [2]. В данной работе исследовалось расщепление хромосомной ДНК крысы по более широкому спектру сайтов узнавания.
Целью настоящей работы явилось получение диаграмм распределения фрагментов при расщеплении хромосомной ДНК крысы по более чем 25 сайтам узнавания, включая 4-х, 5-ти и 6-тинуклеотидные последовательности, и сравнение полученных данных с результатами гидролиза ДНК соответствующими эндонуклеазами рестрикции.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

Хромосомная ДНК крысы

В экспериментах использовали крыс-самцов линии "Sprague-Dowley" в возрасте 3-4 месяца разведения вивария ИЦиГ СО РАН. Выделение хромосомной ДНК из печени крыс проводили по методике [3] с некоторыми модификациями как описано ниже.
Печень крыс немедленно после забоя животного замораживали в жидком азоте. Кусочки ткани переносили в фарфоровую ступку и растирали под слоем жидкого азота до состояния однородного порошка. 0,5-1 г порошка ткани равномерно высыпали в коническую колбу объемом 50 мл, содержавшую 5 мл лизирующего буфера (100 мМ ЭДТА pH 8,0; 0,5% SDS; 40 мкг/мкл протеиназы К). Раствор осторожно перемешивали и инкубировали 3 часа при 55°С.
В колбу добавляли 5 мл фенола, насыщенного 10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и инкубировали при комнатной температуре и постоянном покачивании в течение 15 минут. Смесь переносили в стакан и центрифугировали на 4000 об/мин в течение 5 минут при 20°С. Верхнюю водную фазу переносили в коническую колбу пипеткой с использованием обрезанного ножницами наконечника. В колбу добавляли 5 мл смеси в равных объемах фенол (насыщенный 10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и раствор А (смесь хлороформ/изоамиловый спирт в пропорции 24 к 1) и повторяли экстракцию и центрифугирование как описано выше, после чего к водной фазе добавляли 5 мл раствора А и еще раз повторяли экстракцию и центрифугирование.
Затем водную фазу помещали в стакан объёмом 50 мл и охлаждали на льду. При медленном помешивании тонкой стеклянной палочкой к водной фазе добавляли по каплям охлаждённый до 0°С изопропанол. В момент резкого уменьшения вязкости раствора добавление изопропанола прекращали.
Геномную ДНК в виде вязких гелеобразных нитей собирали, "наматывая" на стеклянную палочку. Палочку с ДНК осторожно промывали 70% этанолом и подсушивали в слабом токе стерильного воздуха 3-6 мин., не допуская полного высыхания. После подсушивания палочку в стерильных условиях помещали в 1-1,5 мл буфера ТЕ (10мМ Трис-НCl pH 7,0; 1мМ ЭДТА) в пробирки объемом 1,5 мл. Растворение проводили при 4°С в течение 1 суток.
Перед проведением реакции гидролиза все препараты ДНК обрабатывали рибонуклеазой А (0,1 мг/мл) 10 минут при комнатной температуре и диализовали в трубках DispoDialyzer MWCO 50,000 ("Sigma", США) против 100 объемов буфера TE (10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА) при 4°С в течение 20 часов.

 

Гидролиз хромосомной ДНК

В работе использовали следующие эндонуклеазы рестрикции производства НПО "СибЭнзим" (в скобках указан сайт узнавания соответствующей рестриктазы):
1) PvuII (5'-CAGCTG-3'), 2) VspI (5'-ATTAAT-3'), 3) PciI (5'-ACATGT-3'), 4) Ksp22I (5'-TGATCA-3'), 5) HindIII (5'-AAGCTT-3'), 6) EcoRI (5'-GAATTC-3'), 7) Bpu10I (5'-CCTNAGC-3'и 5'-GCTNAGG-3'), 8) PctI (5'-GAATGC-3' и 5'-GCATTC-3'), 9) Bse3DI (5'-GCAATG-3'и 5'-CATTGC-3'), 10) SfaNI (5'-GCATC-3' и 5'-GATGC-3'), 11) Bse21I (5'-CCTNAGG-3'), 12) BstV2I (5'-GAAGAC-3' и 5'-GTCTTC-3'), 13) Bst6I (5'-CTCTTC-3'и 5'-GAAGAG-3'), 14) MspI (5'-CCGG-3'), 15) AluI (5'- AGCT-3'), 16) Kzo9I 5'-GATC-3'), 17) TaqI (5'-TCGA-3'), 18) RsaI (5'-GTAC-3'), 19) FatI (5'-CATG-3'), 20) Tru9I (5'-TTAA-3'), 21) Sse9I (5'-AATT-3'), 22) BstDEI (5'-CTNAG-3'), 23) HaeIII (5'-GGCC-3'), 24) AspS9I (5'-GGNCC-3'), 25) Fsp4HI (5'-GCNGC-3'), 26) BspACI (5'-CCGC-3' и 5'-GCGG-3'), 27) HpaII (5'-CCGG-3'), 28) HspAI (5'-GCGC-3'), 29) BstFNI (5'-CGCG-3').
ДНК в количестве 6 мкг расщепляли в 40 мкл реакционной смеси в рекомендуемых производителем SE-буферах для рестрикции ДНК при оптимальных температурах в течение 3 ч.



Электрофорез

Для разделения фрагментов ДНК длиной от 40 до 600 п.о. использовали электрофорез в 8% ПААГ в камере Hoefer SE 600/SE 660 (Amersham USA). Толщина используемого геля - 1,5 мм, длина 140 мм. На гель наносили 6 мкг гидролизованной ДНК на дорожку. Электрофорез проводили в течение 5 часов при напряжении 140 В.
Для выявления более крупных продуктов фрагментов ДНК в диапазоне 500-10000 п.о. использовался электрофорез в 1%-й агарозе "Type I-A, Low EEO" ("Sigma", USA), при этом на гель наносили 3 мкг гидролизованной ДНК на дорожку.
Во всех случаях для электрофореза применяли трис-ацетатный буфер (40 мМ Трис-ацетат, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА). После проведения электрофореза ДНК визуализировали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете.

 

Данные о нуклеотидной последовательности

Последовательность ДНК крысы была получена с ресурса Ensemble (версия от 2 июня 2006 года).

 

Программное обеспечение

Построение диаграмм распределения фрагментов, получаемых при расщеплении ДНК по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции, в виде зависимости суммарной массы фрагментов фиксированной длины, выраженной в парах оснований, от длины фрагментов (в парах оснований) проводили по методике, описанной ранее [2].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами были получены диаграммы распределения фрагментов при расщеплении хромосомной ДНК крысы по сайтам узнавания рестриктаз HaeIII (5'-GGCC-3'), MspI (5'-CCGG-3'), Kzo9I (5'-GATC-3') и Bst2UI (5'-CCWGG-3') и показано хорошее соответствие между расчетными данными и результатами экспериментов по гидролизу ДНК этими ферментами [2]. В настоящей работе мы проводили построение диаграмм распределения фрагментов, получаемых при расщеплении хромосомной ДНК крысы по более широкому спектру сайтов узнавания, включая и шестинуклеотидные последовательности. При этом, в соответствии с предложенным ранее методом [2], диаграммы распределения строились с использованием арктангенсоидной шкалы, имитирующей разделение получаемых фрагментов электрофорезом в агарозном геле. На рис.1а приведены диаграммы расщепления ДНК в основном по шестинуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания как хорошо известных ферментов (HindIII и EcoRI ), так и редко используемых (SfaNI и другие). Для представления на рисунке были выбраны только те диаграммы, которые характеризуются наличием пиков высотой 5,5 и более млн. пар оснований, что, как было показано ранее [2], является пороговой величиной для появления соответствующих полос при анализе продуктов расщепления ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. В таблице 1 собраны данные по 26-ти таким пиковым фрагментам. Как видно из данной таблицы, в большинстве случаев наличие пиков такой высоты объясняется присутствием нескольких фрагментов с размерами, отличающимися на 1-2 нуклеотида, для которых, в соответствии с предложенным методом [2], и вычислялось суммарное значение высоты пика. Образование кластеров таких фрагментов, минимально отличающихся друг от друга размерами, связано, по-видимому, с делециями и инсерциями в повторах ДНК [4], при расщеплении которых и образуются полосы ДНК, видимые на агарозных и акриламидных гелях [2], [5, 6, 7]. Непосредственный анализ ДНК повторов представляется более простым методом получения картины рестрикции in silico, однако ввиду достаточно высокой вариабельности нуклеотидной последовательности в этих участках ДНК, его применение едва ли корректно. Для сравнения мы провели анализ первичной структуры наиболее полного (6914 п.о.) консенсусного LINE1 повтора ДНК крысы [8], имеющейся в базе данных ДНК повторов, и эти данные представлены в четвертом столбце таблицы 1. Как видно из таблицы, наблюдается достаточно высокое соответствие данных, полученных при анализе расщепления геномной ДНК и обобщенного LINE1 повтора. Однако, для ряда сайтов расчетные данные, полученные предложенным нами методом, отличаются от данных анализа консенсусного LINE1 повтора. В частности, в последнем случае оказался пропущенным один из VspI сайтов; наблюдается отличие в размерах PvuII фрагмента и верхних фрагментов Ksp22I и SfaNI гидролизатов ДНК. Сравнение последовательностей LINE1 повторов, представленных в базе данных [9], показало, что в некоторых из них присутствуют дополнительные последовательности длиной 3 п.о. и 133 п.о., которые присутствуют в структуре обобщенного LINE1 повтора [8], но не выявляются ни в эксперименте, ни при анализе расщепления геномной ДНК предложенным нами методом. На основании полученных данных мы предложили новый вариант обобщенного LINE1 повтора крысы [10]. В первичную структуру имеющейся консенсусной последовательности [8] были внесены следующие изменения: 1) делеция 133 п.о в позиции 1294-1426; 2) делеция трех п.о. в позиции 1278-1280; 3) замена A на T в позиции 1438, приводящая к образованию сайта узнавания фермента VspI. Данные по расщеплению нового LINE1 повтора приведены в пятом столбце таблицы 1. Сравнение данных 3-го и 5-го столбцов показывает полное соответствие результатов расщепления геномной ДНК и нового варианта обобщенного LINE1 повтора, предложенного в данной работе. В целом, однако, следует отметить, что по сравнению с предложенным методом анализа геномной ДНК, анализ LINE1 повторов не позволяет оценить количество получаемых фрагментов ДНК и тем самым предсказать их визуализацию в эксперименте. Например, низкомолекулярные фрагменты в гидролизатах EcoRI, SfaNI, BstV2I и ряда других ферментов, получаемые при анализе LINE1 повтора, дают невысокие пики в диаграммах и, как будет показано в дальнейшем, не видны на фотографиях электрофореграмм.

Эндонуклеаза рестрикции Сайт узнавания Длины пиковых фрагментов, п.о.* Длины фрагментов*, получаемых при расщеплении повтора L1_RN [11] Длины фрагментов*, получаемых при расщеплении L1-повтора, созданного в процессе данной работы
PvuII CAGCTG 4549,4550 4685 4549
VspI ATTAAT 3361,3362 - 3362
PciI ACATGT 1171,1172 1172 1172
Ksp 22 I TGATCA 2678,2679
2094,2095
2814
2095
2678
2095
HindIII AAGCTT 3626,3627
179
3627
179
3627
179
EcoRI GAATTC 2316,2317,2318
1372,1373
2318
1373
2318
1373
Bpu 10 I CCTNAGC 2116,2117 2117 2117
PctI GAATGC 2105,2106
641, 619
413
236
2106
641 , 625 **
413
236
2106
641, 625**
413
236
Bse3DI GCAATG 3908,3909 3917 ** 3917**
SfaNI GCATC 2786,2787
1151
437
2922
1170 **
418 **
2786
1170**
418**
Bse21I CCTNAGG 2140,2142
1960,1961,1962
2142
1962
2142
1962
BstV2I GAAGAC 1279,1280
924
747
327
1266 **
924
761 **
327
1266**
924
761**
327
Bst 6 I CTCTTC 2656,2657
2115,2116
2657
2116
2657
2116

 

Таблица 1. Расчетные длины фрагментов, образующихся при расщеплении геномной ДНК крысы, а также опубликованного ранее LINE1 повтора и L1-повтора, созданного в процессе данной работы
* - включены только фрагменты менее 500 п.о. с пиковыми значениями более 4 млн. п.о. и фрагменты более 500 п.о. с пиковыми значениями более 5.5 млн. п.о.
Длины фрагментов в четвертом и пятом столбцах выделены жирным шрифтом в случае совпадения со значениями в третьем столбце.
** - разница в длине фрагментов для случаев гидролиза эндонуклеазами рестрикции PctI, Bse3DI, SfaNI и BstV2I вызвана положением места расщепления ДНК вне сайта узнавания

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper28_fig1.jpg

Рис. 1.
а) Диаграммы распределения фрагментов ДНК, получаемых при расщеплении геномной ДНК крысы по нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Название каждого фермента указанно над соответствующей диаграммой. В центре и справа приведены рассчитанные электрофореграммы распределения маркеров молекулярных весов фрагментов ДНК. (Детальные линейные диаграммы изображены на рисунке 4)
б) анализ продуктов расщепления хромосомной ДНК крысы эндонуклеазами рестрикции. Электрофорез в 1%-ной агарозе. Название эндонуклеазы рестрикции указано над дорожкой геля; M1 - маркер длин фрагментов SE 1kb
в) анализ продуктов расщепления хромосомной ДНК крысы эндонуклеазами рестрикции. Электрофорез в ПААГ. Название эндонуклеазы рестрикции указано над дорожкой геля; M2 - маркер длин фрагментов pUC19/MspI

 


На рис.1б приведены экспериментальные данные по рестрикционному анализу хромосомной ДНК крысы in vitro.
Сравнение расчетных данных в третьем столбце таблицы 1 с экспериментальными результатами показывает, что все указанные фрагменты, присутствуют в виде полос на фотографии агарозного геля. В частности, экспериментально наблюдается наличие полос соответствующего молекулярного веса при гидролизе ДНК крысы ферментами PvuII, VspI, PciI, Ksp22I, HindIII, EcoRI, Bpu10I, PctI, Bse3DI, SfaNI, Bse21I, BstV2I и Bst6I. На рис.1б на дорожках 4 и 15 представлены картины гидролиза хромосомной ДНК ферментами BamHI и PceI, соответственно. Эти ферменты отсутствуют в таблице 1, так как расщепление по сайтам узнавания BamHI и PceI не дает диаграмм с высокими пиковыми значениями. Однако, как видно из рисунка 1б, гидролиз ДНК этими ферментами также приводит к появлению полосы ДНК на электрофореграмме в районе 4500-5000 п.о., особенно хорошо заметной в случае PceI. Кроме того, на дорожке 17, при гидролизе ДНК ферментом Bst6I, заметно наличие дополнительной полосы в районе 4500-5000 пар оснований, представленной небольшим пиком на рис.1 и потому отсутствующей в таблице 1. Детальный анализ диаграмм расщепления ДНК по сайтам узнавания ферментов BamHI, Bst6I и PceI показывает, что во всех трех случаях в области 4500-5000 пар оснований располагается сразу несколько фрагментов, различающиеся размерами в пределах 200 п.о. и имеющие невысокие пиковые значения (данные не приводятся). В этом случае появление полосы не геле, вероятно, связано с невысокой разрешающей способностью электрофореза для фрагментов размерами 4500-5000 пар оснований и может быть следствием перекрывания нескольких небольших пиков. Этим же можно объяснить утолщение верхней полосы, соответствующей фрагментам 2678-2679 п.о., при гидролизе ДНК ферментом Ksp22I.
Из таблицы 1 видно, что согласно полученным диаграммам, среди продуктов расщепления ДНК крысы ферментами HindIII, PctI, SfaNI и BstV2I есть низкомолекулярные фрагменты. Для их анализа проводился электрофорез в ПААГ, который, кроме того, позволяет визуализировать фрагменты с меньшим пиковым значением, так как на дорожку в геле наносится большее количество ДНК. На рис.1в представлены полученные электрофореграммы разделения в ПААГ продуктов гидролиза ДНК крысы эндонуклеазами рестрикции HindIII, PctI, SfaNI и BstV2I. Расщепление ДНК ферментом HindIII приводит к образованию фрагмента 179 п.о., присутствующего в таблице 1, и дополнительного фрагмента размерами 370 пар оснований, образующегося при гидролизе сателлитной ДНК, в которой имеется сайт узнавания фермента HindIII [6]. На рис.1в. видны также все остальные низкомолекулярные фрагменты, присутствующие в 3-ем столбце таблицы 1. PctI образует дубль 641 и 619, а также фрагменты 413 и 236 пар оснований, SfaNI выщепляет фрагмент 437 пар оснований и BstV2I - фрагмент 327 пар оснований. Другие низкомолекулярные фрагменты, которые дает анализ LINE1 повтора для сайтов узнавания данных ферментов, в эксперименте не обнаруживаются, что свидетельствует не в пользу использования данных по повторам при построении диаграмм расщепления ДНК.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper28_fig2.jpg

 

Рис. 2.
а) Диаграммы распределения фрагментов ДНК, получаемых при расщеплении геномной ДНК крысы по нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Название каждого фермента указанно над соответствующей диаграммой. В центре и справа приведены рассчитанные электрофореграммы распределения маркеров молекулярных весов фрагментов ДНК (Детальные линейные диаграммы изображены на рисунке 5)
б) анализ продуктов расщепления хромосомной ДНК крысы эндонуклеазами рестрикции. Электрофорез в 1%-ной агарозе. Название эндонуклеазы рестрикции указано над дорожкой геля. M1 - маркер длин фрагментов SE 1kb
в) электрофорез хромосомной ДНК крысы в ПААГ после обработки эндонуклеазами рестрикции RsaI и AspS9I. M - маркер длин фрагментов pUC19/MspI

 


На рис.2а изображены диаграммы расщепления ДНК в основном по четырехнуклеотидным последовательностям ДНК, при этом числами на них указаны размеры фрагментов с пиковыми значениями более 5,5 млн п.о.. По сравнению с диаграммами на рис.1, в этом случае, в целом, наблюдается образование существенно большего количества фрагментов ДНК, что приводит к появлению базовой кривой распределения фрагментов и пиков на ее фоне. В таблице 2 приведены данные по выбранным пиковым фрагментам, получаемым при расщеплении ДНК по сайтам узнавания указанных ферментов. Как следует их данных таблицы 2, образование пиков и для этих нуклеотидных последовательностей связано с расщеплением LINE1 повторов, тогда как появление базовой кривой является результатом расщепления остальной геномной ДНК. При этом вид этой кривой варьируется в зависимости от анализируемой нуклеотидной последовательности, а для сайтов узнавания ферментов AluI, FatI, Tru9I, Sse9I и BstDEI количество фрагментов в диапазоне длин от 50 до 500 п.о. существенно выше, чем для остальных. На рис.2б представлены результаты электрофореза продуктов гидролиза ДНК крысы эндонуклеазами рестрикции с сайтами узнавания, представленными на рис. 2а. Из сравнения рисунков 2а и 2б видно, что появление базовой кривой распределения фрагментов на диаграммах коррелирует с наличием областей окрашенного пятна ДНК на соответствующих фотографиях гелей. При этом, образование такого пятна затрудняет визуализацию отдельных фрагментов ДНК, имеющих пиковые значения на диаграммах. В связи с этим, на диаграммах на рис.2а числами обозначены размеры только тех фрагментов, которые находятся вне таких затемнений. Сравнение данных, приведенных на рисунках 2а и 2б, показывает, что наблюдается соответствие более чем 25-ти пиковых значений длин фрагментов, полученных на диаграммах, и полос, видимых на фотографии геля. В частности, как ранее было показано [2], при гидролизе ферментами MspI и HaeIII появляются хорошо различаемые полосы, соответствующие пикам 5537+5538 и 404+405 п.о. в первом случае, и 1173, 863, 697, 575+588, а также 370 п.о. (сателлитная ДНК) - во втором случае. При обработке ДНК ферментами AluI, Kzo9I и TaqI заметно появление полос, соответствующих фрагменту 1127 п.о., двойному фрагменту 752 и 768 п.о. и сдвоенному пику 1187 и 1233 п.о., соответственно. Гидролиз ДНК ферментами RsaI, FatI и Tru9I дает по несколько слабых полос, соответствующих пикам 1650, 989, 802 и 555 в первом случае, 1007 и 832п.о. - во втором случае и 703; 573-575 и 447- 468 - в третьем. Гидролиз ДНК ферментами Sse9I и BstDEI не дает четко определяемых полос ввиду их перекрывания с пятном низкомолекулярных фрагментов. Расщепление ферментом AspS9I приводит к появлению дискретных полос, соответствующих пикам 1025+1100 п.о. и 534+554 п.о., а фермент Fsp4HI дает фрагмент 1613 п.о.и менее заметные фрагменты 1463, 1035, 825 и 543 п.о. Как видно на рис.2а, невысокие значения базовой кривой в районе меньше 600 п.о., необходимые для визуализации фрагментов в ПААГ, наблюдаются при расщеплении ДНК по сайтам узнавания ферментов AspS9I, Fsp4HI, HaeIII, Kzo9I, MspI, RsaI и TaqI. Результаты электрофореза в ПААГ продуктов расщепления хромосомной ДНК крысы ферментами HaeIII, Kzo9I и MspI были получены и обсуждались нами ранее [2]. В случае остальных ферментов соответствующие пики на диаграммах есть только при расщеплении ДНК ферментами AspS9I и RsaI. На рис.2в представлены данные электрофореза в ПААГ продуктов расщепления ДНК крысы ферментами AspS9I и RsaI. В первом случае видны полосы, соответствующие фрагментам 456, 374, 353, 202 и 155 п.о., а во втором - 581, 555 и фрагмент сателлитной ДНК длиной 370 п.о. [6], а также слабые полосы, соответствующие фрагментам 330 и 197 п.о.

 

Эндонуклеаза рестрикции Сайт узнавания Длины пиковых фрагментов, п.о.* Длины фрагментов*, получаемых при расщеплении повтора L1_RN [11] Длины фрагментов*, получаемых при расщеплении L1-повтора, созданного в процессе данной работы
MspI CCGG 5537, 5538
404, 405
5673
405
5537
404
AluI AGCT 1127 1127 1127
Kzo9I GATC 768
752
449, 447
337
321
768
752
449
337
321
768
752
449
337
321
TaqI TCGA 1233
1187
1233
1187
1233
1187
RsaI GTAC 1650
802
555
330
197
1650
802
555
330
197
1650
802
555
330
197
FatI CATG 1007
832
648
634
1007
832
648
634
1007
832
648
634
Tru9I TTAA 703
573, 574, 575
468
447
703
574
468
447
703
573
468
447
BstDEI CTNAG  
624
624  
624
HaeIII GGCC 1173
 
863
697
588
575
1173
863
697
588
575
1173
 
863
697
588
575
AspS9I GGNCC 1110
1025
 
554
534
456
374
353
202
155
1110
1025
554
534
456
374
353
202
155
1110
1025
 
554
534
456
374
353
202
155
Fsp4HI GCNGC 1613
 
1035
825
543
1613
1035
825
543
1613
 
1035
825
543
Bst2UI CCWGG 1690, 1691
1017
713
462
341
313
291
215
177
146
1691
1017
713
465
341
313
291
215
177
146
1691
1017
713
461
341
313
291
215
177
146

 

Таблица 2. Расчетные длины фрагментов, образующихся при расщеплении геномной ДНК крысы, а также опубликованного ранее LINE1 повтора и L1-повтора, созданного в процессе данной работы
* - включены только фрагменты менее 500 п.о. с пиковыми значениями более 4 млн. п.о. и фрагменты более 500 п.о. с пиковыми значениями более 5.5 млн. п.о.
Длины фрагментов в четвертом и пятом столбцах выделены жирным шрифтом в случае совпадения со значениями в третьем столбце.


Как видно из приведенных на рис.2б данных, расщепление ДНК рестриктазами TaqI, RsaI и FatI, имеющими сайты узнавания с одинаковым GC составом, приводит к различной глубине гидролиза и расположению пятна ДНК. Соответственно, базовые кривые для сайтов узнавания этих ферментов на рис.2а также существенно отличаются друг от друга. Можно выделить несколько особенностей хромосомной ДНК крысы, от которых зависит глубина гидролиза рестриктазами с одинаковым набором нуклеотидов в сайте узнавания.



1. Блокирование гидролиза геномной ДНК метилированием CG-динуклеотидов

По имеющимся оценкам в геномах млекопитающих 70-80% всех CG-пар метилировано [12]. На рис.3 приведены результаты расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции, содержащими динуклеотид CG в сайте узнавания, в частности, ферментами BspACI: (5'-СCGC-3' и 5'GCGG-3'), BstFNI (5'-CGCG-3'), HspAI (5'-GCGC-3'), HpaII и MspI (5'-CCGG-3'). Как видно из рисунка ферменты BspACI, BstFNI, HspAI и HpaII расщепляют геномную ДНК незначительно, тогда как MspI, который способен расщеплять сайт 5'-CmCGG-3', существенно гидролизует ДНК. Таким образом, из всех проанализированных нами ферментов с CG-динуклеотидом в составе сайта узнавания, только MspI и TaqI, который также нечувствителен к метилированию цитозина в сайте узнавания, эффективно расщепляют хромосомную ДНК (рис. 2б и 3).

Расщепление геномной ДНК крысы эндонуклеазами рестрикции

 

 

 

Рис. 3. Расщепление геномной ДНК крысы эндонуклеазами рестрикции с сайтами узнавания, содержащими CG-динуклеотид. Название эндонуклеазы рестрикции указано над дорожкой геля. M1 - маркер длин фрагментов SE 1kb.

 

 


Кроме того, гидролиз ДНК некоторыми ферменты может быть затруднен в результате перекрывания сайта узнавания с CG-метилированным динуклеотидом. Так, при обработке сателлитной ДНК крысы, часть сайтов узнавания ферментов HinfI (5'-GANTC-3') и EcoRI (5'-GAATTC-3') содержит метелированный цитозин и такой сайт гидролизуются с существенно меньшей скоростью, чем немодифицированный сайт узнавания [5].
Наблюдаемое на рис.2б небольшое смещение положения пятна ДНК при гидролизе ферментами HaeIII и Fsp4HI по сравнению с расчетной базовой кривой для расщепления по сайтам 5'-GGCC-3' и 5'-GCNGC-3', соответственно, видимо, также связано с перекрыванием сайтов узнавания рестриктаз с метилированным CG-динуклеотидом.



2. GC-состав

Геномная ДНК крысы является АТ-богатой и доля GC-пар составляет 40% [13]). Поэтому более глубокий гидролиз должен наблюдаться для рестриктаз, у которых в сайте узнавания доля GC-пар меньше. Как видно из рис. 2, Tru9I и Sse9I, у которых в сайте узнавания содержатся только АТ-пары, дают более глубокий гидролиз, чем ЭР, содержащие в сайте узнавания только GC-пары (например, HaeIII и AspS9I).

 

3. Наличие в сайте узнавания высокочастотных и низкочастотных динуклеотидов

Частота встречаемости некоторых динуклеотидных пар существенно отличается от средней статистически ожидаемой. Этим можно объяснить различие средней длины образуемых рестрикционных фрагментов при гидролизе ДНК ферментами, у которых сайт узнавания имеет один и тот же GC-состав.
Так, при гидролизе ДНК эндонуклеазой рестрикции TaqI (сайт узнавания TCGA) глубина гидролиза хромосомной ДНК существенно меньше, чем при гидролизе ферментами Кzo9I (GATC) и RsaI (GTAC), хотя GC-состав сайтов узнавания всех этих ферментов одинаков. Этот результат можно объяснить тем, что в хромосомных ДНК эукариот частота встречаемости динуклеотида CG в пять раз ниже по сравнению со статистически ожидаемой частотой [14]. Низкая частота встречаемости CG-пары обусловлена, видимо, высокой скоростью перехода образующегося в этом динуклеотиде 5-метилцитозина в тимин в результате реакции спонтанного дезаминирования [15].
Аналогичным образом можно объяснить различие в глубине гидролиза ДНК ферментами HaeIII (сайт узнавания 5'-GGCC-3') и MspI (сайт узнавания 5'-CCGG-3') на рис.1б. Действительно, хотя последовательности узнавания обоих ферментов состоят только из GC-пар, в сайте узнавания MspI присутствует низкочастотный динуклеотид CG, наличие которого приводит к меньшей глубине гидролиза ДНК ферментом MspI чем рестриктазой HaeIII.
Обратная ситуация наблюдается для динуклеотидов TG, CA, AG и CT. Эти динуклеотиды в хромосомной ДНК эукариот представлены с более высокой частотой по сравнению со среднестатистическим значением встречаемости [16, 17]. Этим можно объяснить глубокий гидролиз, который наблюдается на рис.2б для ферментов FatI, (сайт узнавания CATG), AluI (сайт узнавания AGCT) и BstDEI (сайт узнавания CTNAG). В сайте узнавания этих эндонуклеаз рестрикции находятся сразу по два высокочастотных динуклеотида (CA и TG для FatI, AG и CT для AluI и BstDEI).

b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_PvuII.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_VspI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_PciI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Ksp22I.gif
PvuII VspI PciI Kzo22I
b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_HindIII.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_EcoRI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Bpu10I.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_PctI.gif
HindIII EcoRI Bpu10I PctI
b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Bse3DI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_SfaNI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Bse21I.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_BstV2I.gif
Bse3DII SfaNI Bse21I BstV2I
b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Bst6I.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_BamHI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_PceI.gif  
BstV6II BamHI PceI  

Рис. 4. Детальные линейные диаграммы распределения фрагментов ДНК, получаемых при расщеплении геномной ДНК крысы по нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Название каждого фермента указанно под соответствующей диаграммой. Для просмотра полноразмерной диаграммы кликните мышкой на ее уменьшенный вариант.

 

b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_MspI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_AluI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Kzo9I.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_TaqI.gif
MspI AluI Kzo9I TaqI
b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_RsaI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_FatI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Tru9I.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Sse9I.gif
RsaI FatI Tru9I Sse9I
b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_BstDEI.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_HaeIII.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_AspS9I.gif b_160_120_16777215_00_Pics_paper28_rat_Fsp4HI.gif
BstDEI HaeIII AspS9I Fsp4HI

Рис. 5. Детальные линейные диаграммы распределения фрагментов ДНК, получаемых при расщеплении геномной ДНК крысы по нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Название каждого фермента указанно под соответствующей диаграммой. Для просмотра полноразмерной диаграммы кликните мышкой на ее уменьшенный вариант.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для широкого спектра последовательностей узнавания эндонуклеаз рестрикции получены диаграммы расщепления хромосомной ДНК крысы, а также проведены эксперименты по гидролизу ДНК соответствующими ферментами. Теоретически показано существование более чем пятидесяти пиковых значений фрагментов (или кластеров фрагментов) ДНК при расщепления по 25 нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания рестриктаз. Установлено, что абсолютное большинство пиков, получаемых на диаграммах расщепления хромосомной ДНК, соответствуют аналогичным пикам из диаграмм расщепления обобщенного LINE1 повтора. При этом показано, что предложенный метод расчета в случае хромосомной ДНК позволяет получать диаграммы распределения фрагментов ДНК более близкие к экспериментальным результатам, чем в случае расщепления LINE1 повтора. Эксперименты по электрофоретическому разделению продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции проводились в агарозном или акриламидном геле, в зависимости от полученной диаграммы. Проведенное в работе сравнение рассчитанных диаграмм распределения фрагментов ДНК крысы и полученных картин рестрикционного анализа ДНК соответствующими ферментами показывает хорошее соответствие полученных теоретических и экспериментальных данных.

Авторы благодарят к.б.н. Каледина В.И. за помощь в работе с животными и к.б.н. Васильева Г.В. за помощь в выделении ДНК.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Rat Genome Sequencing Project Consortium 2004. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. // Nature - 2004 - Vol.428. - P.493 - 521.
  2. Томилов В.Н., Чернухин В.А., Абдурашитов М.А., Гончар Д.А., Дегтярёв С.Х. Метод рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2007 - Т.3 - №1 - С 29-38. ( онлайн-версия )
  3. Дашкевич В.С., Дымшиц Г.М., Салганик Р.И., Уланов Б.П. О дестабилизации вторичной структуры ДНК регенерирующей печени крыс в процессе репликации // Молекулярная биология. - 1972. - Т.6 - №5. - С 689-697.
  4. Southern E.M., Base sequence and evolution of guinea-pig alpha-satellite DNA 1970, Nature (Lond), 227, 794-798;
  5. Philippsen P., Streeck R.E., Zachau H.G. Defined Fragments of Calf, Human, and Rat DNA Produced by Restriction Nucleases. // European Journal of Biochemistry - 1974 - Vol.45., - P.479-488.
  6. Pech M., Igo-Kemenes T., Zachau H.G. Nucleotide sequence of highly repetitive component of rat DNA. // Nucl. Acids Res. - 1979. - P.417-432.
  7. Horz W., Hess I., Zachau H.G. Highly regular arrangement of restriction nuclease sensitivity site in rodent satellite DNAs. // European Journal of Biochemistry 1974 - Vol.45. - P. 501-512.
  8. Soares, M.B., Schon, E., Efstratiadis A. Rat LINE1: The origin and evolution of long interspersed middle repetitive DNA elements. // Journal of Molecular Evol. - 1985, - Vol.22. - P.117-133
  9. Penzkofer T., Dandekar T., Zemojtel T. L1Base: from functional annotation to prediction of active LINE-1 elements. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, D498-D500.
  10. База данных НПО СибЭнзим - LINE1 ДНК повтор
  11. Jurka J., Kapitonov V.V., Pavlicek A., Klonowski P., Kohany O., Walichiewicz J. (2005) Repbase Update, a database of eukaryotic repetitive elements. Cytogenetic and Genome Research 110: 462-467.
  12. Ehrlich, M., Gama S.M., Huang L.H., Midgett, R.M., Kuo, K.C., McCune, R.A., and Gehrke, C. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues or cells. // Nucl. Acids Res. - 1982 - Vol.10 - P.2709-2721
  13. Калинин Ф.Л., Лобов В.П., Жидков В.А. Справочник по биохимии. "Наукова думка", Киев 1971.
  14. Schorderest D.F., and Gartler S.M. Analysis of CpG suppression in methylated and nonmethylated species. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1992 - Vol.89 - P.957-961.
  15. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. // Nature - 1993 -Vol.362. - P.709-715;
  16. Ohno S. Universal rule for coding sequence construction: TA/CG deficiency-TG/CT excess. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1988 - Vol.85 - P.9630-9634.
  17. Yomo T., Ohno S. Concordant evolution of coding and noncoding regions of DNA made possible by the universal rule of TA/CG deficiency-TG/CT excess.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1989 - Vol.86 - P.8452-8456.

 

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ЭР - эндонуклеаза рестрикции
п.о. - пара оснований
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ПААГ - полиакриламидный гель