Главная  //  Научные статьи  //  Клонирование генов систем рестрикции-модификации  //  Вторая ДНК-метилтрансфераза из системы рестрикции-модификации BstF5I гомологична C-концевым доменам метилаз FokI и StsI

Вторая ДНК-метилтрансфераза из системы рестрикции-модификации BstF5I гомологична C-концевым доменам метилаз FokI и StsI

 

М. А. Абдурашитов, Н. А. Нетесова, Л. Н. Голикова, В. В. Гуторов, П. А. Белавин, С. X. Дегтярев

Молекулярная Биология, 2000, том 34, № 1, с. 87-94

 

Определена нуклеотидная последовательность гена ДНК-метилтрансферазы М.BstF5I-2, входящей в систему рестрикции-модификации штамма Bacillus stearothermophilus F5. На бактериальной хромосоме ген bstF5IM-2 располагается за геном метилазы М.BstF5I-1 и имеет ту же ориентацию. Кодируемый геном bstF5IM-2 белок содержит консервативные участки, специфичные для адениновых ДНК-метилтрансфераз класса D12. ДНК-метилаза М.BstF5I-2 гомологична С-концевым доменам ДНК-метилаз FokI и StsI, имеющим ту же последовательность узнавания. Таким образом, система рестрикции-модификации BstF5I содержит уникальный фермент М.BstF5I-1, модифицирующий верхнюю цепь узнаваемой последовательности, и М.BstF5I-2, гомологичный С-концевым частям ферментов-изошизомеров М.FokI и М.StsI, модифицирующих вторую цепь ДНК в участке узнавания.

 

Сайт-специфичные ДНК-метилтрансферазы (метилазы, М.) широко распространены среди прокариот. Как правило, они вместе с эндонуклеазами рестрикции образуют бактериальную систему рестрикции-модификации, защищающую клетку от внедрения чужеродной ДНК. Метилазы осуществляют перенос метильной группы от S-аденозилметионина на один из нуклеотидов узнаваемой последовательности с образованием N6-метиладенина, С5-метилцитозина или N4-метилцитозина. В соответствии с производимой модификацией ДНК-метилазы разделяются на три группы, причем внутри каждой группы, как показало сравнительное изучение, ферменты имеют целый ряд гомологичных участков, так называемых консервативных мотивов. В молекулах адениновых ДНК-метилаз выявлены 10 различных мотивов [1,2], состав и взаиморасположение которых формируют три подгруппы этих ферментов - D12, D21 и N12 [3], заметно отличающихся друг от друга и по пространственной структуре.
Большая часть адениновых ДНК-метилаз узнает палиндромные участки в ДНК. В этом случае для обеспечения защиты достаточно одной метилазы, так как ею может быть модифицирована каждая из цепей ДНК внутри участка узнавания. Системы рестрикции-модификации с непалиндромным участком узнавания содержат две ДНК-метилтрансферазы, каждая из которых модифицирует лишь одну из цепей ДНК в узнаваемой нуклеотидной последовательности. Исключениями являются система рестрикции-модификации FokI [4] и гомологичная ей система StsI [5], которые содержат по одной метилазе, однако, данные белки состоят из двух доменов [6], каждый из которых содержит полный набор консервативных мотивов типа D12. Размер этих доменов (300-350 аминокислотных остатков) примерно совпадает со средним размером обычных ДНК-метилаз. С помощью генно-инженерных методов клонировали фрагменты ДНК, кодирующие каждый из доменов метилазы FokI (M.FokIN и М.FokIC). Экспрессия этих фрагментов привела к получению двух функционально активных метилаз, модифицирующих только одну из цепей ДНК в участке узнавания фермента [7]. Таким образом, ген метилазы FokI можно рассматривать как продукт слияния двух генов ДНК-метилтрансфераз [8].
Ранее нами был обнаружен штамм F5 Bacillus stearothermophilus, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции BstF5I, которая узнает ту же последовательность нуклеотидов 5'-GGATG-3', что и эндонуклеазы рестрикции FokI и StsI, но расщепляет ДНК в положении 2/0, что существенно отличается от места гидролиза ДНК рестриктазами FokI (9/13) и StsI (10/14) [9]. Мы также клонировали ген ДНК-метилтрансферазы BstF5I-1 из системы рестрикции-модификации BstF5I и показали, что кодируемый этим геном фермент относится к подгруппе D21 метилаз и, соответственно, не гомологичен ни одному из доменов М.FokI и М.StsI, входящих в подгруппу метилаз Dl2 [10]. М.BstF5I-1 метилирует адениновый остаток в верхней цепи узнаваемой нуклеотидной последовательности, как и N-концевые домены М.FokI и М.StsI.
Настоящая работа посвящена клонированию гена и сравнительному анализу первичной структуры второй ДНК-метилтрансферазы (М.BstF5I-2), входящей в систему рестрикции-модификации BstF5I.

 

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Геномную клонотеку получали с помощью частичного гидролиза ДНК В. stearothermophilus F5 эндонуклеазой рестрикции AluI. Рестрикционные фрагменты с использованием лигазной сшивки встраивали в плазмиду pMTL22, обработанную рестриктазой SmaI. Клетки Е. coli RR1 трансформировали дотированными ДНК, выделяли пул плазмид и обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BstF5I. После трансформации клеток Е. coli RR1 продуктами гидролиза рестриктазой BstF5I получили два клона, несущих устойчивые к расщеплению данным ферментом плазмиды. Рестриктазное картирование показало, что полученные плазмиды, названные pF521, идентичны и содержат вставку размером около 1200 п.н. Нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента ДНК определяли с помощью метода Максама-Гилберта.
Поиск гомологии и выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с применением программы FASTA и ALIGN из пакета FASTA 2.0 [11], а множественное выравнивание - с применением программы Clustal W 1.7 [12]. Для просмотра и анализа в сети Интернет пространственной структуры белка М.DpnM, содержащейся в базе данных PDB, использовали ЯВА-апплет QuickPDB v.1.1 (Ilya Shindyalov, Phil Bourne).
Все генно-инженерные манипуляции проводили согласно [13].
В работе использовали препараты ДНК, ферменты и олигонуклеотиды производства ООО "СибЭнзим" (Новосибирск).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Нуклеотидная и аминокислотная последовательности M.BstF5I-2

Ранее мы сообщили о клонировании Кsр22I-Кsр22I-фрагмента В. stearothermophilus F5, содержащего ген метилазы М.BstF5I-1 [10]. Анализ первичной структуры показал, что клонированный нами АluI-АluI-фрагмент ДНК того же штамма перекрывается с геном М.BstF5I-1 на 119 п.н. Объединив известные данные, получили нуклеотидную последовательность из 3363 п.н., представляющую часть хромосомы штамма-хозяина (рис. 1). Изучение последовательности АluI-АluI-фрагмента выявило открытую рамку трансляции (ОРТ), расположенную в позиции 2197-3081. Эта ОРТ имеет хорошо выраженную сигнальную последовательность Шайна-Дальгарно (рис. 2). Защита ДНК плазмиды pF521, несущей данную ОРТ, от гидролиза R.BstF5I однозначно свидетельствует, что она кодирует сайт-специфичную ДНК-метилтрансферазу.
Как показано на рис. 1, два гена ДНК-метилаз BstF5I разделены спейсером из 204 п.н. Ген ДНК-метилтрансферазы М.BstF5I-2 (bstF5IM-2) располагается за геном, кодирующим метилазу М.BstF5I-1, причем оба гена направлены одинаково. Интересно отметить, что между двумя генами находятся тандемный повтор (длины звеньев 33 и 34 п.н., из них 31 п.н. идентичны), инвертированный повтор (длина звена 8 п.н.), а также АТ-богатый участок из 32 п.н. (рис. 2). Пока еще не выяснено, играют ли эти структурные особенности какую-либо роль в транскрипции и трансляции генов оперона системы рестрикции-модификации BstF5I. Можно лишь предположить, что структурная комбинация "инвертированный повтор - АТ-богатая последовательность", аналогичная Rho-независимым терминаторам, но, в отличие от них, не содержащая значительного количества GC-пар в повторе, в данном случае может выполнять роль аттенюатора транскрипции.

 

Расположение генов ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I на секвенированном участке бактериальной хромосомы

 

 

Рис. 1. Расположение генов ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I на секвенированном участке бактериальной хромосомы.

 

 

 

Структура участка, разделяющего два гена ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I

 

 

 

Рис. 2. Структура участка, разделяющего два гена ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I.
Выделены старт-кодон и последовательность Шайна-Дальгарно (SD) в гене bstF5M-2.

 

 


Содержание идентичных нуклеотидных пар в клонированном гене bstF5IM-2 и в последовательностях, кодирующих С-домены метилаз FokI и StsI, составляет 61.6 и 59.6% соответственно. Аминокислотная последовательность белка М.BstF5I-2 содержит все консервативные мотивы, характерные для ДНК-метилтрансфераз класса D12. На рис. 3 приведены результаты выравнивания аминокислотных последовательностей М.BstF5I-2 и С-концевых областей метилаз FokI и StsI. Уровень гомологии составляет 54.0% идентичности и 79.8% сходства с М.FokIC, 49.7% идентичности и 80.7% сходства с М.StsIC. Наличие у М.BstF5I-2 ДНК-метилазной активности, а также данные о гомологии между М.BstF5I-2 и М.FokIC и М.StsIC позволяют утверждать, что М.BstF5I-2 модифицирует адениновое основание в нижней цепи участка узнавания.



Сопоставление аминокислотных последовательностей ДНК-метилаз с пространственной структурой М.DpnM

Недавно была опубликована первая пространственная структура ДНК-метилазы, относящейся к классу D12 ДНК-метилтрансфераз. Этой метилазой является DpnM, узнающая последовательность 5'-GATC-3' и метилирующая адениновое основание в участке узнавания [1]. Молекула М.DpnM имеет С-образную форму, приспособленную для охвата двунитевой ДНК. Два домена М.DpnM, больший из которых содержит полость для размещения кофактора метилаз S-аденозилметионина и реакционный центр, соединены двумя α-спиральными мостиками.
На рис. 3 приведены результаты выравнивания аминокислотной последовательности метилазы М.BstF5I-2, ее изошизомеров М.FokIC и М.StsIC, а также М.DpnM. Как видно из рис. 3, размеры белков и взаимное расположение всех консервативных мотивов у М.BstF5I-2, M.FokIC, М.StsIC и М.DpnM сходны, что должно указывать на сходство их третичных структур, т.е. на аналогичное расположение структурных элементов этих ферментов в пространстве. На рис. 3 отмечены элементы вторичной структуры (α-спирали и β-слои), выявленные в М.DpnM, а также консервативные мотивы, общие у всех метилаз этого типа. Далее в ходе сравнительного изучения всех ДНК-метилаз мы будем использовать названия структурных элементов, принятые для М.DpnM.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper34_fig3.gif

Рис. 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей М.BstF5I-2, С-концевых областей метилаз FokI и StsI и сопоставление их с первичной и вторичной структурами М.DpnM.
Сверху одиночными линиями отмечены консервативные мотивы ДНК-метилтрансфераз (нумерация по [1]), двойной линией указан участок, предположительно отвечающий за узнавание специфической нуклеотидной последовательности TRD.
Полужирным выделены аминокислотные остатки М.DpnM, взаимодействующие с кофактором и метилируемым адениновым остатком ДНК.
Аминокислотные остатки М.DpnM, пространственное расположение которых не установлено, обозначены прописными буквами.
Элементы вторичной структуры М.DpnM отмечены затененными прямоугольниками (α-спирали) и стрелками (β-слои).
Показана степень гомологии аминокислотных остатков трех первых (строка 4) и всех метилаз (строка 6).
Обозначения: * - Означает идентичность, : - функциональное сходство, o - функциональную совместимость

 

Сравнение первичной структуры четырех белков показывает, что, в соответствии с литературными данными, кроме установленных ранее консервативных мотивов и участка TRD (Target Recognition Domain, мишень-узнающий домен) другие достаточно протяженные гомологичные участки, общие у всех четырех белков, отсутствуют. Более высокую степень гомологии имеют участки метилаз, которые соответствуют структурам, образующим ядро большого домена (с полостью для расположения кофактора) и окружающим реакционный центр фермента (αА, β1, αВ, β2, β4, αI, β5 и β7).
Помимо отмеченных структурных элементов, формирующих реакционный центр М.DpnM, должны существовать также элементы, обеспечивающие сайт-специфичное взаимодействие с ДНК. Одним из таких элементов является TRD, расположенный в малом домене между αF и αG, и представляющий собой петлю, выступающую из этого домена. Предполагается, что в сайт-специфичном связывании молекулы ДНК участвуют и две неструктурированные гибкие петли большого домена, обогащенные остатками серина, треонина, аргинина и лизина и расположенные между β4 и αI и между β6 и β7 [1]. Представляет интерес сравнение первичных структур этих петель М.DpnM с соответствующими им участками в молекулах трех других метилаз.
Ведь если эти или какие-либо другие элементы участвуют в сайт-специфическом взаимодействии с ДНК, эти участки, видимо, должны быть гомологичны у М.BstF5I-2, M.FokIC и М.StsIC и отличаться в случае М.DpnM, так как первые три фермента-изошизомера катализируют одну и ту же реакцию - модифицируют аденин в участке 5'-САТСС-3'. В таком случае анализ аминокислотных последовательностей М.BstF5I-2, М.FokIC и М.StsIC, с одной стороны, и М.DpnM, с другой, должен выявить гомологию между такими участками у первых трех ферментов и отсутствие гомологии при сравнении с М.DpnM. Действительно, выявлена практически полная гомология аминокислотных остатков 198-208 М.BstF5I-2 (петля между β4 и αI) изошизомеров FokI и отсутствие гомологии у М.DpnM. В значительно меньшей степени этот феномен выражен у районов TRD и аминокислотной последовательности 276-281 (петля между β6 и β7). Неожиданно высокий уровень гомологии между изошизомерами FokI обнаружен и в положении 8-13 аминокислотной последовательности. Все эти участки не относятся к классическим районам консервативных доменов и, следовательно, гомология аминокислотных последовательностей и пространственное расположение этих участков могут отражать их участие в сайт-специфическом взаимодействии с ДНК.
В. stearothermophilus F5 является термофильной бактерией и, следовательно, ферменты, продуцируемые этим микроорганизмом, обладают термостабильностью, что должно найти отражение в структуре М.BstF5I-2. Из различий в аминокислотном составе можно выделить повышенное содержание остатков цистеина в метилазе М.BstF5I-2 (шесть против трех в М.FokIC и отсутствие в М.StsIC). При сопоставлении аминокислотной последовательности М.BstF5I-2 с пространственной структурой метилазы DpnM видно, что четыре из шести остатков Cys в М.BstF5I-2 (Cys-42, Cys-45, Cys-58 и Cys-190) должны лежать на сближенных участках белковой цепи, образующих полость для S-аденозилметионина. Поэтому вполне вероятно, что образование цистеиновых мостиков является одним из факторов, повышающих термостабильность метилазы BstF5I-2 по сравнению с ее гомологами.



Сравнение аминокислотных последовательностей метилаз группы DpnM, предположительно взаимодействующих с ДНК

На рис. 4 приведены первичные структуры участков метилаз группы DpnM, которые, как отмечено выше, могут принимать участие в специфическом взаимодействии с ДНК. Отдельная колонка справа показывает узнаваемую ДНК-метилазой нуклеотидную последовательность. На рис. 4 учтены данные, появившиеся в последнее время, а также исправлены неверно указанные [1,2] нуклеотидные последовательности, модифицируемые М.FokIC и М.StsIC.
Наибольший уровень гомологии выявлен в участке TRD (рис. 4а). По-видимому, этот район отвечает за взаимодействие с общим ядром узнаваемых последовательностей 5'-(G/C)AT-3'. Положительно заряженные аминокислотные остатки TRD могут взаимодействовать с фосфатными группами остова ДНК, обеспечивая связывание субстрата [1].

b_320_200_16777215_00_Pics_paper34_fig4.gif

 

 

Рис. 4. Аминокислотные последовательности метилаз группы DpnM подкласса D12, предположительно отвечающие за взаимодействие с ДНК. Справа приведены узнаваемые ферментом нуклеотидные последовательности, модифицируемые основания в них выделены заглавным шрифтом. Полужирным выделены наиболее консервативные аминокислотные остатки. Затенены участки, соответствующие элементам вторичной структуры М.DpnM. Обозначение консервативных мотивов и степени гомологии аминокислотных остатков как на рис. 3.

 

 


На рис. 4. приведены структуры N-концевого участка ДНК-метилаз. Лежащий в начале всех метилаз-изошизомеров FokI гомологичный пептидный "хвостик" YIKSPLNY по своему составу заметно отличается у САТСС-узнающих ферментов. В опытах по субклонированию С-домена метилазы FokI показано, что более короткий вариант этого пептида, включающий аминокислотные остатки 369-647, не проявляет ферментативной активности, в то время как больший фрагмент (335-647) способен метилировать ДНК [7]. М.BstF5I-2 всего лишь на 12 аминокислотных остатков длиннее неактивного гомологичного пептида, но обладает ферментативной активностью. По-видимому, этот короткий фрагмент и, прежде всего, полностью идентичная у трех белков последовательность аминокислот YIKSP, играет существенную роль в проявлении у белков модифицирующей ДНК активности, хотя и не входит в консервативный мотив X [1, 2]. Судя по пространственной модели, гомологичный данной последовательности участок метилазы DpnM выполняет структурную роль и не участвует в ДНК-белковом взаимодействии и каталитическом процессе. Но поскольку при взаимодействии с ДНК конформация отдельных участков белков часто существенно изменяется, мы предполагаем, что данная последовательность М.BstF5I-2, M.FokIC и М.StsIC все же может образовывать связи с субстратом. Возможно, что при сближении с ДНК этот элемент входит в соседнюю бороздку двойной спирали и способствует тем самым расширению узнаваемой ферментами нуклеотидной последовательности.
Интересен аминокислотный состав участков метилаз, соответствующих петлям М.DpnM, расположенным между β4 и αI и между β6 и β7 (рис. 4в-г). У М.DpnM не удалось определить пространственное расположение атомов аминокислотных остатков, входящих в эти петли, что свидетельствует об их высокой гибкости. Действительно, данные последовательности содержат в основном аминокислотные остатки с большим коэффициентом локальной гибкости (G, D, S, Р, Т, К, А). Уровень гомологии между аминокислотным составом этих участков в значительной степени коррелирует с различиями в узнаваемых последовательностях (за исключением метилазы М.T4Dam фага Т4, выпадающей из ряда ферментов, узнающих 5'-GATC-3'). На наш взгляд, данные, приведенные на рис. 4в-4г, свидетельствуют о том, что именно эти участки ответственны за узнавание пар нуклеотидов, прилегающих к центральной последовательности 5'-АТ-3'.
Выявленный тандем ДНК-метилаз М.BstF5I-1 и М.BstF5I-2 модифицирует обе цепи ДНК в последовательности 5'-GGATG-3' и обеспечивает, таким образом, функционирование системы рестрикции-модификации В. stearothermophilus. При этом ДНК-метилазы системы рестрикции-модификации BstF5I принадлежат к разным классам ДНК-метилтрансфераз: М.BstF5I-1 - к классу D21, а М.BstF5I-2 - к классу D12. Ранее [9] мы показали, что рестриктаза BstF5I эволюционно связана с рестриктазами из других штаммов В. stearothermophilus, а не с ферментами систем рестрикции-модификации FokI или StsI. Структура ДНК-метилазы BstF5I-l, не имеющей гомологии с метилазами М.FokI и М.StsI, казалось бы подтверждает положение об отсутствии эволюционной связи между этими системами рестрикции-модификации. Однако установленная в данной работе высокая степень гомологии между М.BstF5I-2 и М.FokI (M.StsI) ставит вопрос о происхождении системы рестрикции-модификации BstF5I и ее эволюционной связи с системами рестрикции-модификации FokI и StsI. В самом деле, каким образом в ходе эволюции возникли две столь разные метилазы? Является ли С-домен М.FokI предшественником М.BstF5I-2 или последний возник независимо? Дальнейшее изучение ферментативных свойств М.BstF5I-2 позволит ответить на эти вопросы.


Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (98-04-49514).

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Tran P.H., Korszun Z.R., Cerritelli S., Springhorn S.S., Lacks S.A. // Structure. 1998. V. 6. P.1563-1575.
  2. Malone Т., Blumenthal R.M., Cheng X. // J. Mol. Biol. 1995. V. 253. P. 618-632.
  3. Klimasauskas S., Timinskas A., Menkevicius S., Butk-iene D., Butkus V., Janulaitis A. // Exp. Biol. 1990. V. 1. P. 4-12.
  4. Landry D., Looney M.C., Feehery G.R., Slatko B.E., Jack W.E., Schildkraut I., Wilson G.G. // Gene. 1989. V. 77. P. 1-10.
  5. Kita K., Suisha M., Kotani H., Yanase H., Kato N.//I Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 4167^172.
  6. Sugisaki H., Kita K., Takanami M.// J. Biol. CheM.1989. V. 264. P. 5757-5761.
  7. Leisman O., Roth M., Friedrich Т., Wende W., JeltschA. //Eur. J. BiocheM.1997. V. 251. P. 899-906.
  8. Looney M.C., Moran L.S., Jack W.E., Fehery G.R., Ben-nerJ.S., Slatko B.E., Wilson G.G. // Gene. 1989. V. 80. P. 193-208.
  9. Abdurashitov M.A., Kileva E.V., Shinkarenko N.M., Shevchenko A.V., Dedkov VS., Degtyarev S.Kh. // Gene. 1996. V. 172. P. 49-51.
  10. Degtyarev S.Kh., Netesova N.A., Abdurashitov M.A., Shevchenko A.V. //Gene. 1997. V. 187. P. 217-219.
  11. Pearson W.R., Lipman D.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1988. V. 85. P. 2444-2448.
  12. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4673-4680.
  13. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1982.