Главная  //  Научные статьи  //  Клонирование генов систем рестрикции-модификации  //  Сравнительный анализ гомологичных систем рестрикции-модификации SfeI и LlaBI

Сравнительный анализ гомологичных систем рестрикции-модификации SfeI и LlaBI

 

С. С. Охапкина, Н. А. Нетесова, Л. Н. Голикова, Е. В. Серегина, С, В. Сосновцев, М. А. Абдурашитов, С. X, Дегтярев

Молекулярная биология, 2002, том 36, № 3, с. 438-441

 

Клонирован фрагмент плазмидной ДНК Streptococcus faecalisSE72, содержащий гены системы рестрикции-модификации SfeI. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента выявил высокую гомологию между оперонами систем SfeI и LlaBI из Lactococcus lactis subsp. cremoris W56 (99.2%) с тем же участком узнавания 5-CTRYAG-3'. Существенными отличиями системы SfeI от LlaBI являются дополнительный фрагмент длиной 198 п.н. в гене ДНК-метилтрансферазы и большая длина гена предполагаемого контрольного белка. Отсутствие гомологии между нуклеотидными последовательностями, прилегающими к оперонам двух систем, свидетельствует о горизонтальном переносе оперонов между двумя близкими родами бактерий.

 

Системы рестрикции-модификации (РМ) широко распространены у прокариотических организмов. Основными компонентами этих систем являются ДНК-метилтрансферазы (метилазы, М.) и эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы, R.), узнающие одинаковые нуклеотидные последовательности длиной 4-8 п.н. (участки узнавания). Роль ДНК-метилазы заключается в модификации одного из адениновых или цитозиновых остатков в участке узнавания, что предотвращает расщепление ДНК хозяйской клетки эндонуклеазой рестрикции той же системы [1 , 2]. В ряде случаев в систему РМ входит также контрольный белок (С-белок), служащий активатором транскрипции гена эндонуклеазы. Ген С-белка обычно располагается перед геном рестриктазы и имеет такое же направление транскрипции [3,4]. Некоторые опероны систем РМ находятся не на хромосомах, а на плазмидах [5,6].
Ранее мы идентифицировали рестриктазу SfeI грамположительной аэробной бактерии Streptococcus faecalisSE72, установили ее участок узнавания и позиции расщепления ДНК (5-C↓TRY-AG-3') [7]. В дальнейшем были обнаружены восемь изошизомеров этого фермента [8], причем оперон одной из систем РМ был клонирован (LlaBI, GenBank accession no. X97263 [9]). Гены системы LlaBI локализованы на плазмиде pJW563 из близкородственного стрептококкам вида Lactococcus lactis subsp. cremoris W56.
Настоящая работа посвящена клонированию генов и определению первичной структуры белков системы РМ SfeI, а также сравнительному анализу систем SfeI и LlaBI.

 

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В работе использовали эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигазу фага Т4, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Escherichia coli, dATP, dTTP, dGTP, dCTP производства ООО "СибЭнзим" (Новосибирск). Генно-инженерные манипуляции проводили согласно [10]. Плазмидную ДНК S. faecalis SE72 выделяли с помощью щелочного метода [10]. ДНК секвенировали по методу Сэнгера на приборе ABI 310 [11]. Аминокислотные последовательности выравнивали с использованием программы "ALIGN" из пакета "FASTA 2.0" [12], праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) выбирали с помощью программы "OLIGO" [13].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 

Клонирование гена sfeIM и анализ нуклеотидных последовательностей

Плазмидную ДНК S. faecalis SE72 гидролизовали рестриктазами BamHI, BclI, BglII. Липкие концы частично достраивали с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli в присутствии dATP и dGTP. Полученные фрагменты клонировали в плазмидном векторе pUC19 по участку рестрикции SalI, частично достроенному фрагментом Кленова в присутствии dTTP и dCTP [14]. Клетки Е. coli RRI трансформировали лигированными ДНК, выделяли плазмиды и обрабатывали их рестриктазой SfeI. После повторной трансформации клеток получили три клона. Плазмидные ДНК всех этих клонов обладали устойчивостью к действию рестриктазы SfeI и содержали вставку длиной 6.1 т.п.н. Плазмида названа pMSfeI-1. Из плазмиды удалили фрагмент HindIII длиной 3.4 т.п.н. и получили плазмиду pMSfeI-2 размером 5.4 т.п.н. Эта плазмида также устойчива к действию SfeI и содержит вставку длиной 2.7 т.п.н.
После секвенирования pMSfeI-2 и анализа аминокислотных последовательностей, соответствующих обнаруженным открытым рамкам трансляции (ОРТ), оказалось, что вставка содержит гены sfeIM, sfeIC и начало гена sfeIR, потенциально кодирующего рестриктазу SfeI.
Полную нуклеотидную последовательность ОРТЗ удалось определить с помощью метода селективной супрессии ПЦР [15]. Плазмидную ДНК S. faecalis SE72 гидролизовали рестриктазой SspI и лигировали со специфическим псевдодвухцепочечным адаптором (супрессионным адаптером). Лигазную смесь амплифицировали с праймером, соответствующим внешней части адаптора, и праймером, сконструированным на основе уже известной последовательности гена sfeIR. В результате всех манипуляций получили ПЦР продукт длиной 900 п.н. Полученный фрагмент и вставку плазмиды pMSfeI-2 секвенировали на приборе АВI-310[11].

 

Гомологичные участки во фрагментах ДНК

 

Рис. 1. Гомологичные участки во фрагментах ДНК S. faecalis SE72, L. lactis W56 и E. faecalis V583.
Стрелками обозначены выявленные ОРТ.

 

 


Всего нами определена последовательность нуклеотидов фрагмента плазмидной ДНК S. faecalis SE72 длиной 3584 п.н., содержащего полный оперон системы РМ SfeI (Gen Bank accession no. AY151403). Расположение генов в этом фрагменте соответствует их расположению в опероне системы РМ LlaBI (рис. 1).
Сравнение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов плазмидных ДНК из S. faecalis SE72 и L. lactis subsp. cremoris W56 выявило высокий уровень гомологии на участке длиной 3047 п.н. Существенным отличием оперона системы РМ SfeI от оперона РМ LlaBI является присутствие в нем дополнительного фрагмента длиной 198 п.н. Без учета этого фрагмента плазмидные ДНК двух бактерий на гомологичных участках отличаются лишь 25 п.н. (99.2% идентичности). Область гомологии включает гены ДНК-метилтрансфераз с участком из 153 п.н., прилегающим к их концу, гены предполагаемых С-белков и гены эндонуклеаз рестрикции (за исключением коротких концевых участков). Между генами С-белков и ДНК-метилаз в обеих цепях ДНК находятся участки начала транскрипции, содержащие потенциальные промоторы генов двух систем. После генов ДНК-метилаз расположены инвертированные повторы с длиной звена 20 п.н., выполняющие, очевидно, роль терминаторов транскрипции.
Анализ различающихся участков фрагментов выявил также неполную ОРТ на 5'-конце ДНК S. faecalis SE72. Белковый продукт этой ОРТ обладает высоким уровнем гомологии с белками MobC грамположительных кокков, компонентами систем конъюгативного переноса плазмид. Участок, предшествующий данному гену, содержит инвертированные повторы с длинами звеньев 7 и 14 п.н. и является, по-видимому, областью начала переноса плазмиды (oriT) [16]. Таким образом, плазмида с системой РМ SfeI содержит предполагаемый ген белка MobC и, вероятно, является конъюгативной, т.е. может легко передаваться от штамма к штамму посредством конъюгативного переноса, широко распространенного у Streptococcus и родственных родов [17-19].
Нами также выявлен высокий уровень гомологии между 3'-концевой частью фрагмента ДНК L. lactis W56 и участком ДНК Enterococcus (Streptococcus) faecalis V583 (Contig 1056 от 26.04.2001, предварительные данные получены из сайта Института геномных исследований http://www.tigr.org). Этот участок включает последние 40 п.н. гена эндонуклеазы рестрикции, llaBIR, и прилегающие к нему 298 п.н. Интересно, что у Е. faecalis V583 данная последовательность кодирует белок с явно выраженным сходством с транспозазами. В то же время у L. lactis W56 этот ген, очевидно, является дефектным, поскольку он короче, чем его гомологи, и содержит сдвиги рамки считывания.

 

Сравнение нуклеотидных последовательностей, кодирующих ДНК-метилтрансферазы М.SfeI и М.LlaBI

 

 

Рис. 2. Сравнение нуклеотидных последовательностей, кодирующих ДНК-метилтрансферазы М.SfeI и М.LlaBI (двойными линиями подчеркнуты участки, узнаваемые эндонуклеазой рестрикции ClaI) (а) и сравнение аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз класса N12 с гомологичной областью, кодируемой sfeIM.
Одиночными линиями подчеркнуты консервативные мотивы (СМ) ДНК-метилтрансфераз.
Наиболее консервативные аминокислотные остатки выделены жирным.

 



Сравнение генов ДНК-метилтрансфераз

Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой sfeIM, выявил в ней все консервативные участки, характерные для ДНК-метилтрансфераз класса γ по классификации Уилсона [20] или N12 по классификации [21]. Наиболее существенным отличием двух нуклеотидных последовательностей является дополнительный фрагмент длиной 198 п.н. в гене sfeIM (рис. 2а). Данный фрагмент разделяет участки, кодирующие консервативные мотивы I и IV ДНК-метилтрансфераз [22]. Выравнивание аминокислотных последовательностей наиболее сходных метилаз класса N12 показывает, что у всех представителей данного класса, за исключением М. LlaBI, между этими мотивами расположен участок длиной 30-70 аминокислотных остатков, содержащий консервативные мотивы II и III (рис. 26). По всей видимости, соответствующий фрагмент гена llaBIM был утрачен при встраивании кассеты генов устойчивости к хлорамфениколу по ClaI-сайту в плазмиду pJW563 [9], хотя по данным авторов в штамме-реципиенте, трансформированном полученной плазмидой pJWCl, сохранена метилазная активность. На возможную потерю фрагмента ДНК указывает и присутствие на концах избыточного фрагмента гена sfeIM ClaI-сайтов 5' -ATCGAT-3 ' (рис. 2a). В остальной части генов двух метилаз длиной 1740 п.н. обнаружены только 9 различий, которые приводят к замене пяти аминокислотных остатков в соответствующих белках.

 

Контрольный белок системы РМ SfeI и ОРТ X системы LlaBI

Существует предположение, что короткая ОРТ, лежащая между генами метилазы и эндонуклеазы рестрикции системы РМ LlaBI (названа ОРТ X [9]) кодирует регуляторный белок. Ген из системы РМ SfeI, соответствующий данной ОРТ (рис. 1), имеет большую длину (225 п.н. в sfeIC против 93 п.н. в ОРТ X). Это различие вызвано делецией в ОРТ X 1 п.н. в положении 86 от инициаторного кодона по сравнению с геном sfeIC. Множественное выравнивание известных аминокислотных последовательностей функционально активных С-белков систем РМ показывает, что они по своей длине сходны с С.SfeI (рис. 3). Поэтому делеция 1 п.н. в ОРТ X системы РМ LlaBI привела, вероятно, к потере функции регуляторного белка. С другой стороны, вполне возможно, что при определении нуклеотидной последовательности оперона РМ LlaBI допущена ошибка.

 

Гены эндонуклеаз рестрикции

Сравниваемые гены существенно различаются лишь 3'-концевыми участками, кодирующими последние семь аминокислотных остатков у R.SfeI и 13 - у R.LlaBI. В остальных 858 п.н. найдены лишь 10 отличий, которые приводит к замене пяти аминокислотных остатков в белках.

 

Выравнивание аминокислотных последовательностей С-белков различных систем РМ и С. SfeI

 

 

 

Рис. 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей С-белков различных систем РМ и С. SfeI.
Наиболее консервативные аминокислотные остатки выделены жирным.

 

 

 


Свидетельства горизонтального переноса генов систем РМ у грамположительных кокков
Нуклеотидные последовательности, окружающие зону высокой гомологии двух сравниваемых фрагментов, совершенно различны, поэтому с большой долей уверенности можно утверждать, что сходство двух систем РМ бактерий двух родов объясняется горизонтальным переносом генетического материала, произошедшим относительно недавно по эволюционным меркам. Об этом свидетельствует и то, что в обоих случаях содержание GC-пар в оперонах систем РМ значительно отличается от GC-состава окружающих областей (таблица 1).

 

Вид Весь геном [23] Участок, прилегающий к гену метилазы Оперон системы РМ Различающиеся 3'-концевые участки
Streptococcus faecalis
Lactococcus lactis
34-38
39
47(~150п.н.) 27 (-3000 п.н.) 19 (98 п.н.)
40 (384 п.н.)

Таблица 1. Содержание CG-пар (%) во фрагментах плазмидных ДНК, несущих системы РМ
Примечание. В скобках указаны длины нуклеотидных участков.


Так как GC-состав оперонов систем SfeI и LlaBI не соответствует видовым и родовым характеристикам S. faecalis и L. lactis, можно предположить, что общая для них система-предшественник возникла не в этих видах, а в какой-то другой бактерии, после чего была перенесена и распространилась среди грамположительных кокков. Видимо, в дальнейшем акты переноса происходили неоднократно среди микроорганизмов с различным GC-содержанием (и, следовательно, относящимся к совершенно неродственным группам), при этом иногда наблюдался захват соседних с оперонами участков ДНК. Это могло бы объяснить присутствие в клонированных фрагментах областей, содержащих 47 и 19% GC-nap.
Поскольку фрагмент ДНК, прилегающий к 3'-концу оперона llaBI, обладает высокой гомологией с ДНК из Е. faecalis V583 и является, видимо, дефектным геном транспозазы, можно с большей вероятностью предположить, что система РМ была перенесена из плазмиды S. faecalis SE72 в плазмиду из L. lactis W56. Это согласуется и с тем, что система РМ SfeI [7] открыта на 8 лет раньше, чем LlaBI [9].
Таким образом, результаты сравнительного изучения гомологичных систем РМ двух штаммов близкородственных родов бактерий служат еще одним подтверждением того, что горизонтальный перенос генов не является исключительным явлением у прокариотических организмов.

Секвенирование генома Е. faecalis V583 проведено при поддержке Национального института аллергии и инфекционных болезней (NIAID, США).

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Wilson G., Murray N. // Annu. Rev. Genet. 1991. V. 25. P. 585-627.
  2. Heitman J. // Genetic Engineering / Ed. Setlow J.K. N.Y.: Plenum Press, 1993. V. 15. P. 57-108.
  3. Tao Т., Bourne J.C., Blumenthal R.M. // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 1367-1375.
  4. Vijesurier R.M., Carlock L., Blumenthal R.M., Dunbar J.С. //. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 477-487.
  5. Chopin A., Chopin M.-C, Moillo-Batt A., Langella P. // Plasmid. 1984. V. 11. P. 260-263.
  6. Calvin-Koons M.D., Blumenthal R.M. // Gene. 1995. V. 157. P. 73-79.
  7. Дегтярев С.Х., Приходько Г.Г., Речкунова И.И. // Биоорган, химия. 1988. Т. 14. С. 848-849.
  8. Roberts R.J., Macelis D. // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 268-269.
  9. Nyengaard N.R., Falkenberg-Klok J., Josephsen J. I I Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 3494-3498.
  10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.
  11. Сайки Р., Гиленстен У., Эрлих Г. // Анализ генома. Методы / Под ред. Дейвиса К. М.: Мир, 1990. С. 184-190.
  12. MaxamJ.M., Gilbert W.C. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 74. P. 7191-7203.
  13. Pearson W.R., Lipman D.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 2444-2448.
  14. Zabarovsky E.R., Allikmets R.L. // Gene. 1986. V. 42. P. 119.
  15. SiebertP.D., ChenchikA., Kellogg D.E., LukyanovK.A., Lukyanov SA. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 1087-1088.
  16. Lanka E., Wilkins B.M. // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 141-169.
  17. Wang A., Macrina F.L. // J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 4199-4206.
  18. MillsDA.yPhister T.G., DunnyG.M., McKayLL. //Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 1541-1544.
  19. Berg Т., Firth N., Apisiridej S., Hettiaratchi A.A., Lee-laporn A., Skurray R.A. // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 4350-4359.
  20. Wilson G.G. //Methods Enzymol. 1992. V. 216. P. 259-279.
  21. Timinskas A., Butkus V., Janulaitis A. I I Gene. 1995. V. 157. P. 3-11.
  22. Malone Т., Blumenthal R.M., Cheng X. // J. Mol. Biol. 1995. V. 253. P. 618-632.
  23. Bergey's manual of systematic bacteriology. // Ed. Holt J.G. Baltimore: Williams and Wilkins Press, 1986. V. 2. P. 1043-1066.