Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа

А.Г. Акишев, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 5 - 16

 

Метод BlsI- и GlaI- ПЦР анализа был использован для определения статуса метилирования регуляторных областей генов-онкосупрессоров SEPT9b, IGFBP3, CEBPD, MGMT и RASSF1A в ДНК малигнантных клеточных линий HeLa, Raji, U-937 и Jurkat, а также в контрольной ДНК клеточной линии фибробластов L-68. BlsI- и GlaI-ПЦР анализ показал, что регуляторные области генов-онкосупрессоров RASSF1A, SEPT9b, IGFBP3, CEBPD и MGMT могут как содержать метилированные последовательности 5’-R(5mC)GY-3’, так и не иметь этих сайтов в зависимости от малигнантной клеточной линии, из которой выделялась ДНК. В ДНК исследованных клеточных линий наблюдались различные комбинации генов-онкосупрессоров с метилированными сайтами. При этом в здоровых клетках линии фибробластов L-68 не было обнаружено сайтов 5’-R(5mC)GY-3’ ни в одной из упомянутых регуляторных областей. На основе полученных результатов предлагается применять BlsI- и GlaI-ПЦР анализ для эпигенетического типирования малигнантных клеточных линий. 

 

А.Г. Акишев, Д.А. Гончар, М.А. Абдурашитов, С.Х. Дегтярев

Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 5 - 16

 

Метод BlsI- и GlaI- ПЦР анализа был использован для определения статуса метилирования регуляторных областей генов-онкосупрессоров SEPT9b, IGFBP3, CEBPD, MGMT и RASSF1A в ДНК малигнантных клеточных линий HeLa, Raji, U-937 и Jurkat, а также в контрольной ДНК клеточной линии фибробластов L-68. BlsI- и GlaI-ПЦР анализ показал, что регуляторные области генов-онкосупрессоров RASSF1A, SEPT9b, IGFBP3, CEBPD и MGMT могут как содержать метилированные последовательности 5’-R(5mC)GY-3’, так и не иметь этих сайтов в зависимости от малигнантной клеточной линии, из которой выделялась ДНК. В ДНК исследованных клеточных линий наблюдались различные комбинации генов-онкосупрессоров с метилированными сайтами. При этом в здоровых клетках линии фибробластов L-68 не было обнаружено сайтов 5’-R(5mC)GY-3’ ни в одной из упомянутых регуляторных областей. На основе полученных результатов предлагается применять BlsI- и GlaI-ПЦР анализ для эпигенетического типирования малигнантных клеточных линий.

 

ВВЕДЕНИЕ

Метилирование ДНК в геномах млекопитающих происходит главным образом по CpG-динуклеотидам и приводит к образованию 5-метилцитозиновых остатков (M) в обеих цепях ДНК. Во многих случаях регуляторные участки генов млекопитающих, включающие в себя промоторы и первые экзоны, содержат последовательности ДНК с повышенным одержанием G+C, называемые CpG-островками (Antequera F., 2003) [4]. Метилирование этих островков в регуляторных областях приводит к блокированию транскрипции и является, таким образом, механизмом эпигенетической регуляции активности генов.
В норме для ДНК каждой ткани характерен совершенно определенный набор функционирующих генов, тогда как остальные гены неактивны вследствие метилирования их регуляторных участков. Изменение статуса метилирования генов в той или иной ткани может привести к ее ненормальному функционированию и возникновению заболеваний, в частности, развитию канцерогенеза (Bird, 2002). Известно, что на ранних стадиях канцерогенеза происходит метилирование регуляторных областей ряда генов, являющихся активными в здоровой ткани (de Caseres et al., 2007). Такое ненормальное (аберрантное) метилирование было показано для целого ряда генов-онкосупрессоров в опухолевых тканях, причем оно сохраняется и в малигнантных клеточных линиях, полученных из этих тканей (Киселева и Лихтенштейн, 2004; de Caseres et al., 2007). Аберрантное метилирование описано для нескольких десятков генов-онкосупрессоров, причем набор модифицируемых генов отличается в различных опухолях и малигнантных клеточных линиях (Mishra et al., 2010 ).
Метилирование ДНК de novo у млекопитающих осуществляют ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a и Dnmt3b, которые узнают последовательность 5’-RCGY-3’ и модифицируют внутренний CG-динуклеотид (Handa et al., 2005). Прямое определение метилированных цитозинов в регуляторных участков генов-онкосупрессоров в препаратах ДНК из опухолевых тканей выявило наличие консенсусной последовательности 5’-RMGC-3’/3’-YGMG-5’ (Kim et al., 2008), которая соответствует продукту реакции метилирования ферментами Dnmt3a и Dnmt3b.
Недавно мы разработали метод BlsI- и GlaI- ПЦР анализа, который позволяет определять наличие сайтов 5’-RMGYNRMGY-3’ и 5’-RMGY-3’, соответственно, в изучаемом участке ДНК (Гончар и др., 2010). Метод заключается в обработке ДНК метилзависимыми эндонуклеазами GlaI или BlsI и последующей ПЦР с праймеров, окаймляющих исследуемый фрагмент ДНК. Метод был применен для определения метилированных сайтов в регуляторных областях генов-онкосупрессоров DAPK1, RASSF1A и RARB (Гончар и др., 2010).
В настоящей работе мы использовали BlsI- и GlaI- ПЦР анализ для определения наличия сайтов 5’-RMGYNRMGY-3’ и 5’-RMGY-3’, соответственно, в области промотора и первого экзона генов-онкосупрессоров SEPT9b, IGFBP3, CEBPD и MGMT в препаратах ДНК из хорошо изученных малигнантных клеточных линий HeLa, Raji, U-937, Jurkat и из контрольной клеточной линии фибробластов L-68. Нами также проведено более детальное изучение метилирования регуляторного участка гена RASSF1A в указанных клеточных линиях.
BlsI- и GlaI- ПЦР анализ показал, что изучаемые регуляторные области генов- онкосупрессоров RASSF1A, SEPT9b, IGFBP3, CEBPD и MGMT могут как содержать последовательности 5’-RMGY-3’, так и не иметь этих метилированных сайтов в зависимости от малигнантной клеточной линии, из которой выделялась ДНК. В исследованных клеточных линиях наблюдались различные комбинации генов-онкосупрессоров с метилированными сайтами. При этом в здоровых клетках контрольной линии фибробластов L-68 не было обнаружено сайтов 5’-RMGY-3’ ни в одной из упомянутых регуляторных областей. Полученные результаты показывают, что определение статуса метилирования регуляторных областей генов-онкосупрессоров методом BlsI- и GlaI- ПЦР анализа дает возможность как определять, так и дифференцировать малигнантные клеточные линии. Таким образом, метод BlsI- и GlaI- ПЦР анализа может быть применен для эпигенетического типирования малигнантных клеточных линий человека.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

Исследуемые области генома человека

В работе изучались пять участков ДНК: области промоторов и первых экзонов генов RASSF1A (Ras association domain family 1A), SEPT9b (septin 9b), MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase), IGFBP3 (insulin-like growth factor binding protein 3), а также промоторная область гена CEBPD (CCAAT/enhancer binding protein, delta).

 

Гидролиз геномной ДНК

В качестве субстратов для ПЦР использовались препараты ДНК, выделенной из пяти клеточных линий: L-68 (контроль, легочные фибробласты), HeLa (аденокарцинома шейки матки), Raji (лимфома Беркитта), U-937 (гистиоцитарная лимфома) и Jurkat (Т-лимфобластная лейкемия). Геномная ДНК из линий клеток человека, эндонуклеазы рестрикции HaeIII, TaqI, Tru9I, метилзависимые сайт-специфические эндонуклеазы BlsI и GlaI, а также HotStart Taq-ДНК полимераза - производства компании СибЭнзим (Новосибирск, Россия). ДНК из Drosophila melanogaster любезно предоставила Л. П. Захаренко.
5 мкг геномной ДНК расщепляли 50 ед. акт. TaqI или Tru9I в 50 мкл реакционной смеси в буфере, указанном производителем, при 65°С в течение 2 ч (предварительная обработка). Фенольную экстракции и последующую очистку ДНК проводили по стандартной методике (Sambrook et al., 2001).
0,1 мкг предварительно обработанной ДНК инкубировали в 20 мкл реакционной смеси, содержащей либо 100 ед. акт. HaeIII, либо 16 ед. акт. BlsI, либо 16 ед. акт. GlaI, в реакционном буфере, рекомендованном производителем, при температуре 37°C (для HaeIII) или 30°C (для BlsI и GlaI) в течение 2 ч. После инкубации ферменты инактивировались путем прогрева (80°C для HaeIII, 65°C - в случае BlsI и GlaI) в течение 20 мин. 1 мкл реакционной смеси, содержащей 5 нг ДНК, использовали в ПЦР.

 

Полимеразная цепная реакция

Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси в приборе "Терцик" (“ДНК-Технология”, Россия) с использованием набора для GC-ПЦР, HotStart Taq ДНК-полимеразы и праймеров, указанных в таблице 1 (все препараты производства компании СибЭнзим). Детальные условия проведения ПЦР указаны в таблице 2.

 

Ген Обозначение праймера Структура
CEBPD Cd1 5’-CCTGGAGTGCTGGCAGAGGGAGTGTC-3’
Cr1 5’-GGGCCGGGCTCTGCGTCCAA-3’
MGMT Md1 5’-GGCGTGCCGGCGTCCAGCG-3’
Mr1 5’-GGAGCGAGGCGACCCAGACACTCACC-3’
IGFBP3 Id1 5’-GCAGGTGCCCGGGCGAGTCTCGA-3’
Ir1 5’-CTCCCGCAGCGGCACCCAGCA-3’
RASSF1A Rd1 5’-CCGGATGTGGGGACCCTCTTCCTCTAGC-3’
Rd2 5’-GCCATGTCGGGGGAGCCTGAGCTCA-3’
Rr1 5’- CTGTGGCCCAGATACGAGTGGAGTGCGAC-3’
Rr2 5’-GGCCACTACTCACGCGCGCACTGCA-3’
Rr3 5’- GCTCAATGAGCTCAGGCTCCCCCGAC-3’
SEPT9b Sd1 5’-CTGCCCAAATACAGCCTCCTGCAGAAGG-3’
Sd2 5’-CGCCTTCCTCCCCCATTCATTCAGCTG-3’
Sd3 5’-CGACCCGCTGCCCACCAGCCATC-3’
Sr1 5’-CCCTAGGCCCCCTGGCTCAGCTG-3’
Sr2 5’-CGTTGACCGCGGGGTCCGACATG-3’
Sr3 5’-CGAGGAGGTCGCTGTCGCTTGGCA-3’

Таблица 1. Структура праймеров, использованных в ПЦР


ПЦР-продукты разделялись путем электрофореза в 1,2 % агарозе “Low EEO, Type 1-A” (“Sigma”, США) в трис-ацетатном буфере (40 mM Трис-ацетат, pH 8,0; 1 mM ЭДТА). После проведения электрофореза ДНК визуализировали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете. Для оценки длин фрагментов использовали ДНК-маркер "100 bp" производства компании СибЭнзим.

 

Ген

Длина фрагмента ПЦР

Первичная денатурация

Амплификация

Заключительная стадия

Число циклов

1.Денатурация

2.Отжиг

3.Полимеризация

Время

Время

Время

Время

Время

CEBPD

341 bp

95°C

2 min

38

96°C

15 sec

67°C

20 sec

72°C

25 sec

72°C

1 min

MGMT

356 bp

95°C

5 min

38

96°C

15 sec

71°C

20 sec

72°C

25 sec

72°C

1 min

IGFBP3

817 bp

95°C

5 min

38

95°C

20 sec

70°C

20 sec

72°C

50 sec

72°C

1 min

RASSF1A

804 bp

95°C

2 min

38

95°C

20 sec

68°C

20 sec

72°C

50 sec

72°C

1 min

385 bp

95°C

2 min

38

95°C

20 sec

69°C

20 sec

72°C

25 sec

72°C

1 min

266 bp

95°C

2 min

38

95°C

15 sec

71°C

20 sec

72°C

20 sec

72°C

1 min

SEPT9b

432 bp

95°C

3 min

38

96°C

15 sec

69°C

20 sec

72°C

30 sec

72°C

1 min

197 bp

95°C

3 min

38

96°C

15 sec

70°C

20 sec

72°C

20 sec

72°C

1 min

399 bp

95°C

2 min

38

96°C

15 sec

71°C

20 sec

72°C

30 sec

72°C

1 min

Таблица 2. Условия проведения ПЦР

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

 

Анализ метилирования ДНК

В настоящей работе с помощью метода BlsI- и GlaI-ПЦР анализа мы исследовали метилирование CpG-островков, расположенных в регуляторных участках нескольких генов-онкосупрессоров (CEBPD, RASSF1A, SEPT9b, MGMT и IGFBP3A). Расположение этих участков в геноме человека согласно сборке GRCh37.p2 представлено в таблице 3.

 

Ген-онкосупрессор Хромосома и позиция в ней фрагмента ДНК Расположение
фрагмента ДНК в геноме человека
Число сайтов во фрагменте ДНК
RCGY RCGYNRCGY
CEBPD 8—8p11.2-p11.1 515 093 – 515 433 11 1
MGMT 10—10q26 2 499161 – 2 499 516 16 0
IGFBP3 7—7p13-p12 45 951 065 – 45 950 249 41 1
RASSF1A 3—3p21.3 50 318 593 – 50 317 790 26 1
SEPT9b 17—17q25 40 643 169 – 40 644 107 33 3

Таблица 3. Расположение изучаемых областей генов-онкосупрессоров в геноме человека (в соответствии со сборкой GRCh37. p5)


Структура регуляторных областей всех изучаемых генов-онкосупрессоров представлена на рис. 1. Как показано на этом рисунке и в таблице 3, число сайтов 5’-RCGY-3’ и 5’-RCGYNRCGY-3’ в выбранных фрагментах ДНК существенно различается. Нами проводилось определение метилированных сайтов 5’-RMGY-3’ и 5’-RMGYNRMGY-3’ в регуляторных областях генов-онкосупрессоров в препаратах ДНК из пяти клеточных линий; четыре из них - это известные культуры малигнантных клеток (HeLa, Jurkat, Raji и U-937), а пятая - линия фибробластов L-68, использовавшаяся в качестве контроля. До проведения анализа все препараты геномной ДНК обрабатывались эндонуклеазой рестрикции, которая не содержит сайтов узнавания в выбранных фрагментах (Tru9I в случаях SEPT9b и IGFBP3, TaqI для остальных случаев), в соответствии с процедурой предобработки ДНК, используемой для бисульфитного анализа геномной ДНК (Clark et al., 1994).

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper58_fig2.png

 

 

Рис. 1. Схемы регуляторных областей генов CEBPD, RASSF1A, SEPT9b, MGMT и IGFBP3 . Сайты узнавания эндонуклеазы рестрикции HaeIII обозначены вертикальными черточками. Сайты 5’-RCGY-3’ обозначены кружочками. Сайты 5’-RCGYNRCGY-3' вынесены ниже. Старт транскрипции обозначен изогнутой стрелкой. Размер фрагмента ДНК указан справа от каждой схемы. Расположение праймеров показано стрелками.

 


Все препараты ДНК из клеточных линий по отдельности обрабатывались:
1) ферментом рестрикции, сайты которого есть в изучаемой области ДНК (HaeIII) - положительный контроль;
2) GlaI (узнает 5’-RMGY-3’, Tarasova et al., 2008);
3) BlsI (узнает 5’-RYNRY-3' при наличии 5-метилцитозина в каждой цепи сайта узнавания); BlsI расщепляет последовательность 5’-RMGYNRMGY-3’/3’-YGMRNYGMG-5’, состоящую из двух сайтов 5’-RMGY-3’, разделенных одним нуклеотидом (сайт BlsI подчеркнут);
4) в качестве отрицательного контроля использовались препараты, не обработанные ферментами.
После инкубации ДНК в четырех реакционных смесях служила матрицей для проведения ПЦР. Анализ ПЦР-продуктов проводили с использованием электрофореза, а не с помощью ПЦР в реальном времени, ввиду относительно больших длин части получаемых фрагментов ДНК (341 п.н., 678 п.н. и три фрагмента с длиной более 800 п.н.). ДНК из Drosophila melanogaster в той же концентрации использовалась в качестве отрицательного контроля ПЦР. На рисунке 2 показаны результаты BlsI- и GlaI-ПЦР анализа пяти регуляторных участков.

 

CEBPD

На рисунке 2а представлены данные BlsI- и GlaI-ПЦР анализа промоторной области гена CEBPD. Как видно из рисунка, продукт ПЦР длиной 341 п.н. присутствует в положительном контроле (дорожки 5, 9, 13, 19 и 23) и отсутствует при гидролизе ДНК из клеток Raji и U-937 ферментами GlaI и BlsI (дорожки 11, 12, 17 и 18). В изучаемом фрагменте ДНК находится всего одна последовательность 5’-RCGYNRCGY-3', которая в случае метилирования может расщепляться ферментом BlsI (5’-GCGCAGCGC-3’, рис. 1a). Согласно результатам BlsI-ПЦР анализа данная последовательность остается неметилированной в ДНК L-68, HeLa и Jurkat и превращается в полностью метилированную последовательность 5’-GMGCAGMGC-3’/3’-CGMGTCGMG-5’ в клетках Raji и U-937. Таким образом, согласно данным BlsI- и GlaI-ПЦР анализа как минимум два метилированных сайта 5’-RMGY-3’ присутствуют в CpG-островке в промоторной области гена CEBPD в ДНК из Raji и U-937, тогда как в препаратах ДНК из контрольной линии L-68 и малигнантных линий HeLa и Jurkat изучаемый фрагмент ДНК длиной 341 п.н. не содержит метилированных сайтов 5’-RMGY-3’. Полученные данные свидетельствуют об активности гена CEBPD в клетках контрольной линии L-68 и малигнантных линий HeLa и Jurkat, тогда как в клетках Raji и U-937 этот ген, видимо, не активен из-за наличия метилированных сайтов 5’-RMGY-3’ в промоторной области.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper58_fig3.png

 

 

Рис. 2. BlsI- и GlaI- ПЦР анализ выбранных областей. Предобработанная ДНК из L-68 (2-5), HeLa (6-9), Raji (10-13), U-937 (16-19), Jurkat (20-23); ДНК из Drosophila melanogaster (14 и 24); HaeIII (2, 6, 10, 16, 20); GlaI (3, 7, 11, 17, 21); BlsI (4, 8, 12, 18, 22); без добавления фермента (5, 9, 13, 19, 23); ДНК маркер "100 bp" (1, 15, 25). Обозначения праймеров для ПЦР (см. рис. 1) и длины областей показаны справа.

 

 



Как сообщалось ранее, отсутствие белка CEBPD в клетках вызывает геномную нестабильность, включая перестройки хромосом, с последующей потерей контроля над клеточным ростом (Huang et al., 2004). Интересно, что такие хромосомные перестройки описаны как для клеток Raji (Karpova et al., 2005), так и для клеток U-937 (Strefford et al., 2001). Таким образом, наши результаты подтверждают предполагаемую связь между выключением гена CEBPD и некоторыми разновидностями лейкемии.

 

MGMT

Рисунок 2б демонстрирует результаты BlsI- и GlaI-ПЦР анализа области промотор/первый экзон гена-онкосупрессора MGMT. Продукт ПЦР длиной 356 п.н. образуется во всех случаях GlaI- ПЦР анализа за исключением препарата ДНК из клеток U-937 (рис. 2б, дорожка 17). Таким образом, CpG-островок в области промотор/первый экзон гена MGMT имеет как минимум один сайт 5'-RMGY-3' в клетках U-937, тогда как в остальных малигнантных клеточных линиях и контрольных клетках L-68 этот фрагмент ДНК не содержит сайтов 5'-RMGY-3'. BlsI-ПЦР анализ дает отрицательный результат для препаратов ДНК из всех клеточных линий, что, вероятно, связано с отсутствием сайтов 5’- RCGYNRCGY-3’ в изучаемом участке ДНК (рис. 1б).
Экспрессия гена MGMT ранее изучалась в U-937, Jurkat, Raji и некоторых других клеточных линиях. Активность гена не была выявлена в клетках U-937, тогда как довольно высокая активность этого гена была обнаружена в клетках Jurkat и Raji (Horton et al., 2009). Полученные нами результаты соответствуют этим литературным данным.

 

IGFBP3

На рисунке 2в представлены результаты BlsI- и GlaI-ПЦР анализа регуляторной области гена IGFBP3. Фрагмент ДНК рассчитанной длины (817 п.н.) образуется при амплификации ДНК из контрольной линии клеток L-68 и малигнантных клеток HeLa при гидролизе ДНК как GlaI, так и BlsI (дорожки 3-4 и 7-8), в то время как этот фрагмент не наблюдается при ПЦР анализе препаратов ДНК из других малигнантных клеточных линий.
В анализируемом фрагменте ДНК длиной 817 п.н. присутствует всего одна последовательность 5’- RCGYNRCGY-3’, которая в случае метилирования может расщепляться ферментом BlsI (5’-GCGCTGCGT-3’, рис. 1в). В соответствии с полученными результатами последовательность 5’-GCGCTGCGT-3’остается неметилированной только в ДНК L-68 и HeLa и превращается в метилированную последовательность 5’-GMGCTGMGT-3’/3’-CGMGACGMA-5’ в клетках Jurkat, Raji и U-937. Таким образом, согласно данным BlsI- и GlaI-ПЦР анализа как минимум два метилированных сайта 5’-RMGY-3’ присутствуют в регуляторной области гена IGFBP3 в ДНК из клеточных линий Jurkat, Raji и U-937, тогда как в препаратах ДНК из контрольной линии L-68 и малигнантных линий HeLa исследуемая область промотора и первого экзона не содержит метилированных сайтов 5’-RMGY-3’.
Ранее было показано, что уровень белка IGFBP3 в раковых клетках может уменьшаться во время развития некоторых онкологических заболеваний, включая рак простаты (Miyake et al., 2000), эндометриоидную карциному яичника (Torng et al., 2009) и рак прямой кишки (Kawasaki et al., 2007). Полученные нами данные показывают, что метилирование регуляторной области гена IGFBP3 и, вероятно, последующее падение уровня соответствующего белка происходит и в случае лейкемических заболеваний, хотя инактивация данного гена не наблюдается в клетках рака шейки матки линии HeLa.

 

RASSF1A

Ранее мы провели BlsI- и GlaI-ПЦР анализ ДНК фрагмента длиной 804 п.н., содержащего CpG-островок регуляторной области гена RASSF1A, и показали, что он содержит сайты 5’-RMGY-3’ только в клетках Raji и Jurkat (Гончар и др., 2010). На рисунке 2г представлены результаты более детального анализа распределения метилированных сайтов 5’-RMGY-3’ в этом фрагменте ДНК.
Помимо целого фрагмента 804 п.н. нами были отдельно проанализированы промоторная область гена RASSF1A (фрагмент ДНК длиной 385 п.н.) и часть первого экзона (фрагмент ДНК длиной 266 п.н.) с расположенной внутри его последовательностью 5’-GCGCTGCGC-3’ (рис. 1г). На рисунке 2г представлены результаты BlsI- и GlaI-ПЦР анализа трех указанных фрагментов ДНК. ПЦР продукт расчетной длины наблюдается при анализе всех трех фрагментов в случае препаратов ДНК из контрольной линии клеток, а также ДНК из клеток HeLa и U-937 (дорожки 3-4, 7-8, 17-18 на рисунке 2г). Не наблюдается целевого ПЦР продукта при амплификации фрагментов 804 п.н. и 266 п.н. при анализе ДНК из клеток Raji и Jurkat (ряды 1 и 3, дорожки 11-12, 21-22). что объясняется метилированием вышеуказанной последовательности 5’-GCGCTGCGC-3’ с образованием сайта 5’-GMGCTGMGC-3’/3’CGMGACGMG-5’, расщепляемого ферментом BlsI (Гончар и др., 2010).
Не такая однозначная картина наблюдается в случае GlaI- ПЦР анализа фрагмента длиной 385 п.н. На данном фрагменте BlsI-ПЦР анализ дает отрицательный результат при анализе всех препаратов ДНК (ряд 2, дорожки 4, 8, 12, 18, 22), что, вероятно, связано с отсутствием внутри него сайтов 5’- RCGYNRCGY-3’. В тоже время GlaI- ПЦР анализ показал наличие метилированных сайтов 5’-RMGY-3’ в изучаемом фрагменте только в клетках Raji и Jurkat (ряд 2, дорожки 11 и 21), что соответствует данным, полученным при анализе фрагментов 804 п.н. и 266 п.н. Однако следует отметить, что если фрагменты 804 п.н. и 266 п.н. отсутствуют при GlaI- ПЦР анализе ДНК из клеток Raji и Jurkat (ряды 1 и 3, дорожки 11 и 21), то в случае фрагмента 385 п.н. ПЦР продукт все-таки образуется, хотя и в меньшей степени, чем в контроле (дорожки 13 и 23).
Изучение метилирования области промотор / первый экзон гена RASSF1A проводилось также в работах других авторов (Hesson et al., 2007; Feng et al., 2008; Peters et al., 2007). Кроме того, проводилось и детальное исследование этого участка в клетках рака молочной железы (Yan et al., 2003). В ряде клеточных линий авторы обнаружили значительную степень метилирования первого экзона на участке, содержащем сайт 5’-GCGCTGCGC-3’, и менее выраженное метилирование области промотора, что соответствует нашим данным.

 

SEPT9b

Регуляторный участок гена SEPT9b включает в себя три сайта 5’-RCGYNRCGY-3’, расположенные после старта транскрипции (рисунок 1д) и расщепляемые BlsI в случае их метилирования. Мы проводили BlsI- и GlaI-ПЦР анализ отдельно для трех участков ДНК, каждый из которых содержал один сайт 5’-RCGYNRCGY-3’, определяя, таким образом, статус метилирования трех соседних перекрывающихся между собой фрагментов на всей области промотор / первый экзон (432, 197 и 399 п.н.). Данные, приведенные на рисунке 2д, показывают, что все три фрагмента метилированы одинаково для каждой из клеточных линий. Амплифицированные фрагменты ДНК с рассчитанными длинами наблюдаются только в случаях контрольных клеток фибробластов и клеток линии Jurkat (рис. 2д, ряды 1–3, дорожки 3-4 и 21–22). Полученные результаты свидетельствуют, что сайт 5’-RMGYNRMGY-3’ присутствует в каждом анализируемом участке в ДНК из клеток HeLa, Raji и U-937, тогда как эти последовательности не метилированы во всей регуляторной области в клетках L-68 и Jurkat.
Аберрантное метилирование регуляторной области гена SEPT9b в опухолевых клетках было описано у больных раком прямой кишки (Grutzmann et al., 2008). Результаты нашего исследования показывают, что анормальное метилирование по сайтам 5’-GMGCNGMGC-3’ также обнаруживается и в других малигнантных клетках.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

 

Определение статуса метилирования регуляторных областей генов-онкосупрессоров методом BlsI- и GlaI- ПЦР анализа

Метилирование ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров является основной причиной их инактивации (Jones and Baylin, 2002) и наблюдается на ранних стадиях развития канцерогенеза (de Caseres et al., 2007). В связи с этим определение статуса метилирования этих участков ДНК является важной задачей при ранней диагностике онкопатологий. В последнее время для выявления метилированных оснований применяется метод бисульфитной конверсии ДНК, который позволяет проводить прямое определение 5-метилцитозинов в интересующем участке ДНК (Grigg, 1996), однако этот метод имеет ряд недостатков и в повседневной клинической практике практически не используется. В данной работе разработанный нами метод BlsI- и GlaI-ПЦР анализа (Гончар и др., 2010) был применен для определения сайтов 5’-RMGY-3’ и 5’-RMGYNRMGY-3’ в регуляторных областях генов-онкосупрессоров CEBPD, RASSF1A, SEPT9b, MGMT и IGFBP3. Результаты, полученные методом BlsI- и GlaI-ПЦР анализа, показали хорошее соответствие с литературными данными по анализу регуляторных участков генов-онкосупрессоров методом бисульфитной конверсии ДНК. При этом метод BlsI- и GlaI-ПЦР анализа является простым в исполнении и в большинстве случаев дает однозначный результат (есть метилированные сайты 5’-RMGY-3’ или нет), а в случае BlsI-ПЦР анализа полученный результат был однозначным во всех экспериментах. BlsI-ПЦР анализ показал либо наличие сайтов 5’-RMGYNRMGY-3’ в изучаемом фрагменте во всех анализируемых молекулах ДНК той или иной клеточной линии, либо их полное отсутствие. Это позволяет рассматривать BlsI- и GlaI-ПЦР анализ как простой и однозначный метод определения статуса метилирования регуляторных областей генов-онкосупрессоров.

 

Распределение сайтов 5'-RMGY-3' в регуляторных участках

Ранее мы использовали GlaI- ПЦР анализ для определения метилирования ДНК в регуляторном участке гена RARB в малигнантных линиях клеток HeLa, Jurkat, Raji, U-937 и контрольной линии клеток L-68 (Гончар и др., 2010). При этом было выявлено наличие сайта 5’-RMGY-3’ в изучаемом участке ДНК во всех опухолевых клетках и отсутствие такового в клетках фибробластов. BlsI-ПЦР анализ регуляторной области гена DAPK1 показал, что метилированная последовательность 5’-GMGCCGMGC-3’/3’-CGMGGCGMG-5’ присутствует только в ДНК клеток Raji (Гончар и др., 2010).
Результаты, полученные нами в настоящей работе, вместе с данными, опубликованными ранее (Гончар и др., 2010), представлены в таблице 4. Таблица включает результаты определения статуса метилирования регуляторных участков генов-онкосупрессоров RARB, DAPK1, CEBPD, RASSF1A, SEPT9b, MGMT и IGFBP3 методом BlsI- и GlaI-ПЦР анализа. Как видно из таблицы, BlsI- и GlaI-ПЦР анализ выявил различные комбинации регуляторных участков генов-онкосупрессоров с метилированными сайтами 5’-RMGY-3’ во всех пяти клеточных линиях человека.

 

Метод GlaIПЦР анализ BlsI/GlaI ПЦР анализ BlsI ПЦР анализ
Клеточная линия Ген RARB MGMT CEBPD IGFBP3 RASSF1A SEPT9b DAPK1
L-68
фибробласты легкого
- - - - - - -
HeLa
аденокарцинома шейки матки
+ - - - - + -
Raji
лимфома Беркитта
+ - + + + + +
U-937
гистиоцитарная лимфома
+ + + + - + -
Jurkat
Т-лимфобластная лейкемия
+ - - + + - -

Таблица 4. Объединенные данные результатов BlsI- и GlaI- ПЦР анализа



BlsI-ПЦР анализ дает отрицательный результат при изучении генов RARB и MGMT, вероятно, ввиду отсутствия сайтов 5’-RCGYNRCGY-3’ в регуляторных областях этих генов, тогда как GlaI- ПЦР анализ позволяет установить различие в статусе метилирования данных участков ДНК в изучаемых клеточных линиях. Если в случае гена RARB сайты 5’-RMGY-3’ присутствуют в регуляторной области в ДНК всех изученных малигнантных линий, но не клеток контрольной линии фибробластов, то CpG-островок гена MGMT содержит данный сайт только в клетках U-937 (табл. 4).
GlaI- ПЦР анализ и BlsI-ПЦР анализ показали одинаковые результаты при изучении метилирования регуляторных областей каждого из генов-онкосупрессоров CEBPD, IGFBP3, SEPT9b и RASSF1A, за исключением промоторной области последнего. Однако при этом, препараты ДНК из всех изученных клеточных линий различаются по комбинациям метилированных генов: промотор гена CEBPD метилирован лишь в клетках Raji и U-937; промотор и первый экзон гена RASSF1A метилированы только в клетках Raji и Jurkat; промотор и первый экзон гена SEPT9b метилирован в клетках U-937, Raji и HeLa; промотор и первый экзон гена IGFBP3 метилирован в клетках U-937, Raji и Jurkat.
GlaI- ПЦР анализ промоторной области ген RASSF1A в ДНК из клеток Raji и Jurkat показал, что в отличие от фрагментов 804 и 266 нуклеотидов, расположенных в первом экзоне и содержащих сайты 5’-RMGY-3’ во всех молекулах анализируемых ДНК, последовательность 5’-RMGY-3’ присутствует во фрагменте 385 п.н. лишь в части молекул ДНК данных клеток. Можно предположить, что в клетках Raji и Jurkat промоторная область гена RASSF1A содержит сайт 5’-RMGY-3’ только в одной аллели генома, тогда как в первом экзоне данного гена последовательность 5’-GMGCTGMGC-3’с двумя сайтами 5’-RMGY-3’ присутствуют в обеих аллелях хромосомного набора клеток. Дальнейшая работа по GlaI- ПЦР анализу данной области ДНК в режиме реального времени позволит проверить сделанное предположение.

Анализ структуры ДНК в области сайтов узнавания BlsI. При BlsI-ПЦР-анализе регуляторных участков генов-онкосупрессоров было найдено, что каждый из семи сайтов 5’-RCGYNRCGY-3’ (с учетом ранее исследованного регуляторного участка гена DAPK), присутствующих в изучаемых фрагментах ДНК (см. рис. 1 и работу Гончар и др., 2010), метилирован, по крайней мере, в одной малигнантной клеточной линии. В случаях CpG-островков генов IGFBP3 и SEPT9b эти сайты метилированы в трех разных клеточных линиях (за исключением линий HeLa и Jurkat, соответственно). В регуляторных областях генов CEPBD и RASSF1A эти последовательности метилированы в двух различающихся клеточных линиях (Raji, U-937 и Raji, Jurkat, соответственно). Сайт 5’-GCGCCGCGC-3' в CpG-островке гена DAPK1 метилирован только в клетках Raji. Таким образом, сайты 5’-RCGYNRCGY-3' в регуляторных областях генов-онкосупрессоров метилированы в различных комбинациях в зависимости от клеточной линии, из которой выделялась ДНК, однако каждый из сайтов метилирован в ДНК хотя бы в одной клеточной линии. На рисунке 3 представлена нуклеотидная последовательность семи фрагментов ДНК, которые содержат сайты 5’-RCGYNRCGY-3'. Сравнительный анализ структуры ДНК не выявил какого-либо сходства окрестностей сайтов у всех фрагментов. Однако, следует отметить, что каждый из фрагментов содержит прямые повторы, окружающие сайты 5’-RCGYNRCGY-3'. Эти повторы имеют длину 5–6 п.н. и располагаются на разных расстояниях от сайта 5’-RCGYNRCGY-3’. При этом они состоят преимущественно из G и С нуклеотидов.

 

Схемы регуляторных областей генов CEBPD, RASSF1A, SEPT9b, MGMT и IGFBP3

 

Рис. 3. Первичная структура коротких ДНК фрагментов с сайтами 5’-RCGYNRCGY-3' (выделены серым). Прямые повторы ДНК выделены подчеркиванием.

 



Типирование малигнантных клеточных линий

Присутствие метилированных сайтов 5’-RMGYNRMGY -3’ в регуляторных участках генов DAPK1, CEBPD, IGFBP3, RASSF1A и SEPT9b, отличающееся для изученных малигнантных клеточных линий, позволяет предложить простой способ типирования опухолевых клеточных линий на основе результатов BlsI- и/или GlaI- ПЦР анализа указанных участков ДНК. Важно отметить, что результатом такого BlsI- и/или GlaI- ПЦР анализа является либо наличие, либо отсутствие ПЦР продукта, что позволяет достаточно просто получать и интерпретировать результаты анализа.
Аутентификация клеточных линий – это очень важная проблема современной биологии. Хорошо известно, что многие из клеточных линий, поддерживаемых в лабораториях, неправильно идентифицированы или загрязнены (Stacey, 2000; Nardone, 2007; Capes-Davis et al., 2010). Для аутентификации клеточных линий используется большое число методов, таких как изоферментный анализ, кариотипирование, однонуклеотидный полиморфизм (SNP), полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP). Недавно в качестве стандарта характеризации и определения клеточных линий, а также для подтверждения чистоты культур клеток, был предложен метод профилирования коротких тандемных повторов (STR) (Alston-Roberts et al., 2010; Barallon et al., 2010). Для использования цитологических и биохимических методов идентификации (морфологические наблюдения, кариотипирование и изоферментный анализ) требуются серьезные различия в свойствах и внешнем виде клеток. Эти методы обычно недостаточно надежны и непригодны в качестве обычных лабораторных процедур. Современные молекулярные подходы, основанные на вариабельности ДНК, более точны и прогресс в стандартизации некоторых из них может иметь большое значение для клеточной биологии и онкологии.
Однако, ни один из перечисленных методов не учитывает эпигенетический аспект при идентификации клеточных линий, который особенно важен для клеточных линий, выделенных из раковых опухолей. Хорошо известно, что статус метилирования определенных участков ДНК является важным признаком малигнантности, при этом различия в метилировании CpG-островков наблюдаются у многих из малигнантных клеточных линий (Issa, 2004). Таким образом, определение статуса метилирования регуляторных областей генов-онкосупрессоров является важным критерием при определении и дифференциации малигнантных клеточных линий. В настоящей работе нами показано, что комбинация статусов метилирования семи регуляторных участков генов-онкосупрессоров различается в каждой из анализируемых малигнантных клеточных линий (табл. 4). Таким образом, BlsI-ПЦР анализ регуляторных областей ДНК может быть использован для быстрой эпигенетической характеризации малигнантных клеточных линий.

 

Заключение

BlsI- и GlaI- ПЦР анализ применен для определения статуса метилирования регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека SEPT9b, IGFBP3, CEBPD, MGMT и RASSF1A. Статус метилирования регуляторных участков генов-онкосупрессоров определялся по наличию в них метилированных сайтов 5’-RMGY-3’. Каждая из исследованных малигнантных клеточных линий (HeLa, Raji, U-937 и Jurkat) отличается от других по комбинации регуляторных участков, содержащих метилированные сайты 5’-RMGY-3’. ДНК из клеток контрольной линии фибробластов L-68 не содержит сайтов 5’-RMGY-3’ ни в одной из упомянутых регуляторных областей.
BlsI- и GlaI- ПЦР анализ
а) промоторной области гена CEBPD установил наличие метилированных сайтов 5’-RMGY-3’ в ДНК из клеткок Raji и U-937;
б) области промотор / первый экзон гена RASSF1A показал метилирование ДНК в клетках Raji и Jurkat;
в) области промотор / первый экзон гена SEPT9b выявил метилирование ДНК в клетках U-937, Raji и HeLa;
г) области промотор / первый экзон гена IGFBP3 продемонстрировал метилирование ДНК в клетках U-937, Raji и Jurkat.
GlaI- ПЦР анализ области промотор / первый экзон гена MGMT выявил метилирование ДНК только в клетках U-937.
Эти результаты позволяют определять статус метилирования регуляторных участков генов-онкосупрессоров методом BlsI- и GlaI-ПЦР анализа и рассматривать его результаты как специфическую характеристику малигнантных клеточных линий. Такая характеризация может оказаться полезной для определения малигнантных клеточных линий и дополнить другие методы типирования этих клеток.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Гончар Д.А., Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова – 2010. – Т. 6. – № 1 – С. 5–12. (интернет-версия)
  2. Киселева Н.П., Лихтенштейн А.В. Эпигенетические изменения в опухолевых клетках. Роль метилирования ДНК в канцерогенезе. Канцерогенез. / Под ред. Д.Г.Заридзе. – М.: Медицина, 2004. – С. 191–203.
  3. Alston-Roberts C., Barallon R., Bauer S.R., Butler J., Capes-Davis A. et al. Cell line misidentification: the beginning of the end // Nat. Rev. Cancer – 2010. – Vol. 10 – P. 441–448.
  4. Antequera F. Structure, function and evolution of CpG island promoters // Cell. Mol. Life Sci. – 2003. – Vol. 60. – P. 1647–1658.
  5. Barallon R., Bauer S.R., Butler J., Capes-Davis A., Dirks W.G. et al. Recommendation of short tandem repeat profiling for authenticating human cell lines, stem cells, and tissues // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. – 2010. – Vol. 46. – P. 727–732.
  6. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes. Dev. – 2002. – Vol. 1. – P. 6–21.
  7. Capes-Davis A., Theodosopoulos G., Atkin I., Drexler H.G., Kohara A. et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines // Int. J. Cancer. – 2010. – Vol. 127. – P. 1–8.
  8. de Caseres I.I., Cairus P. Methylated DNA sequences for early cancer detection, molecular classification and chemotherapy response prediction // Clin. Transl. Oncol. – 2007. – Vol. 9. – P. 429–437.
  9. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines // Nucleic Acids Res. – 1994. – Vol. 22. – P. 2990–2997.
  10. Feng Q., Hawes S.E., Stern J.E., Wiens L., Lu H. et al. DNA methylation in tumor and matched normal tissues from non-small cell lung cancer patients // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2008. – Vol. 17. – P. 645–654.
  11. Grigg G.W. Sequencing 5-methylcytosine residues by the bisulphite method // DNA Seq. – 1996. – Vol. 6. – P. 189–198.
  12. Grutzmann R., Molnar B., Pilarsky C., Habermann J.K., Schlag P.M. et al. Sensitive Detection of Colorectal Cancer in Peripheral Blood by Septin 9 DNA Methylation Assay // PLoS ONE. – 2008. – Vol. 3. – e3759.
  13. Handa V., Jeltsch A. Profound sequence preference of Dnmt3a and Dnmt3b mammalian DNA methyltransferases shape the human epigenome // J. Mol. Biol. – 2005. – Vol. 348. – P. 1103–1112.
  14. Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. The role of RASSF1A methylation in cancer // Dis. Markers. – 2007. – Vol. 23. – P. 73–87.
  15. Horton T.M., Jenkins G., Pati D., Zhang L., Dolan M.E. et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor ABT-888 potentiates the cytotoxic activity of temozolomide in leukemia cells: influence of mismatch repair status and O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity // Mol. Cancer Ther. – 2009. – Vol. 8. – P. 2232–2242.
  16. Huang A.M., Montagna C., Sharan S., Ni Y., Ried T., Sterneck E. Loss of CCAAT/enhancer binding protein delta promotes chromosomal instability // Oncogene. – 2004. – Vol. 23. – P. 1549–1557.
  17. Issa J.-P. CpG island methylator phenotype in cancer // Nat. Rev. Cancer. – 2004. – Vol. 4. – P. 988-993.
  18. Jones P.A, Baylin S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer// Nat. Rev. Genet. – 2002. – Vol.3. – P.415–428.
  19. Karpova M.B., Schoumans J., Ernberg I., Henter J.-I., Nordenskj?ld M., Fadeel B. Raji revisited: cytogenetics of the original Burkitt's lymphoma cell line // Leukemia. – 2005. – Vol. 19. – P. 159–161.
  20. Kawasaki T., Nosho K., Ohnishi M., Suemoto Y., Kirkner G.J., Fuchs C.S., Ogino S. IGFBP3 promoter methylation in colorectal cancer: relationship with microsatellite instability, CG island methylator phenotype, and p53 // Neoplasia. – 2007. – Vol. 9. – P. 1091–1098.
  21. Kim S., Li M., Paik H., Nephew K., Shi H., Kramer R., Xu D., Huang T.-H. Predicting DNA methylation susceptibility using CpG flanking sequences // Pac. Symp. Biocomput. – 2008. – Vol. 13. – P. 315–326.
  22. Mishra D.K., Chen Z., Wu Y, Sarkissyan M., Koeffler H.P., Vadgama J.V. Global methylation pattern of genes in androgen-sensitive and androgen-independent prostate cancer cells // Mol. Cancer Ther. – 2010. – Vol. 9. – P. 33–45.
  23. Miyake H., Pollak M., Gleave M.E. Castration-induced up-regulation of insulin-like growth factor binding protein-5 potentiates insulin-like growth factor-I activity and accelerates progression to androgen independence in prostate cancer models // Cancer Res. – 2000. – Vol. 60. – P. 3058–3064.
  24. Nardone R.M. Eradication of cross-contaminated cell lines: a call for action // Cell Biol. Toxicol. – 2007. – Vol. 23. – P. 367–372.
  25. Peters I., Rehmet K., Wilke N., Kuczyk M.A., Hennenlotter J., Eilers T., Machtens S., Jonas U., Serth J. RASSF1A promoter methylation and expression analysis in normal and neoplastic kidney indicates a role in early tumorigenesis // Mol. Cancer. – 2007. – Vol. 6. – N. 49.
  26. Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: A laboratory manual / 3rd ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press., 2001.
  27. Stacey G.N. Cell contamination leads to inaccurate data: we must take action now // Nature. – 2000. – Vol. 403. – P. 356.
  28. Strefford J.C., Foot N.J., Chaplin T., Neat M.J., Oliver R.T.D., Young B.D., Jones L.K. The characterisation of the lymphoma cell line U937, using comparative genomic hybridisation and multi-plex FISH // Cytogenet. Cell Genet. – 2001. – Vol. 94. – P. 9–14.
  29. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.K. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Mol. Biol. – 2008. – Vol. 9. – N. 7. (интернет-версия)
  30. Torng P.L., Lin C.W., Chan M.W., Yang H.W., Huang S.C., Lin C.T. Promoter methylation of IGFBP-3 and p53 expression in ovarian endometrioid carcinoma // Mol. Cancer. – 2009. – Vol. 8. – N. 120.
  31. Yan P.S., Shi H., Rahmatpanah F., Hsiau T.H., Hsiau A.H., Leu Y.W. Liu J.C., Huang T.H. Differential distribution of DNA methylation within the RASSF1A CpG island in breast cancer // Cancer Res. – 2003. – Vol. 63. – P. 6178–6186.