Научные статьи // Эпигенетика
GlaI-ПЦР-анализ в режиме реального времени регуляторных областей генов HDAC4, RARB and URB1 человека
- Категория: Эпигенетика
- Просмотров: 3840
Дубинин Е.В., Акишев А.Г., Абдурашитов А.А., Олейникова С.Б., Ситько В.Л., Дегтярев С.Х.
RES J PHARM BIOL CHEM SCI Volume 7, Issue 2, 2016 (March - April)
GlaI-ПЦР-анализ в режиме реального времени (GlaI-РВ-ПЦР-анализ) разработан для определения статуса метилирования регуляторных областей генов HDAC4, URB1, RARB в препаратах ДНК из лейкоцитов человека. GlaI-РВ-ПЦР-анализ заключается в гидролизе ДНК метил-зависимой сайт-специфической ДНК эндонуклеазой GlaI с последующей ПЦР в реальном времени с праймеров, окаймляющих место гидролиза. Полученные данные подтверждают полное метилирование изученных сайтов ACGT и GCGC в регуляторных областях генов HDAC4 и URB1 и полный гидролиз этих сайтов эндонуклеазой GlaI. Первый экзон гена RARB слегка метилируется в препаратах ДНК из лейкоцитов человека и в соответствии с полученными данными GlaI-РВ-ПЦР-анализа мы делаем вывод об отсутствии гидролиза сайта ACGCG в гене RARB эндонуклеазой GlaI . Полученные данные соответствуют литературным. Предлагаемый способ GlaI-ПЦР-анализа в режиме реального времени может быть использован для определения статуса метилирования любых уникальных участков в геноме человека и млекопитающих.
Применение метода GLAD-ПЦР анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ELMO1 и ESR1 при колоректальном раке
- Категория: Эпигенетика
- Просмотров: 5789
А.А.Евдокимов, Н.А.Нетесова, Н.А.Сметанникова, М.А.Абдурашитов, А.Г.Акишев, Е.С.Давидович, В.В. Кузнецов, Ю.Д.Ермолаев, А.Б.Карпов, А.Э.Сазонов, Р.М.Тахауов, С.Х.Дегтярев
Вопросы онкологии, №1, 2016, стр. 116-120
Аберрантное метилирование регуляторных областей генов-онкосупрессоров показано для многих онкологических заболеваний. В данной работе разработанный нами ранее метод GLAD-ПЦР анализа [3] был применен для выявления сайтов R(5mC)GY, возникающих при аберрантном метилировании регуляторных областей генов ELMO1 и ESR1 в препаратах ДНК клеточной линии SW837 и тканей опухоли толстой кишки. Были отобраны по 4 сайта для каждого гена и установлено, что в ДНК SW837 наиболее метилированными являются сайт GCGC в первом экзонe гена ELMO1 и сайт GCGT в промоторе гена ESR1. Сайт GCGT в промоторе гена ESR1 слабо метилирован в здоровых тканях и более метилирован в большинстве опухолевых тканей. Сайт GCGC в первом экзонe гена ELMO1 неметилирован в ДНК здоровых тканей и метилирован в 60% образцов опухолевых ДНК. Обсуждаются возможности применения метода GLAD-ПЦР анализа препаратов внеклеточной ДНК крови пациентов для диагностики колоректального рака.
Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью BlsI- и GlaI ПЦР анализа
- Категория: Эпигенетика
- Просмотров: 12619
Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7 – № 3 – С. 5 - 16
Метод BlsI- и GlaI- ПЦР анализа был использован для определения статуса метилирования регуляторных областей генов-онкосупрессоров SEPT9b, IGFBP3, CEBPD, MGMT и RASSF1A в ДНК малигнантных клеточных линий HeLa, Raji, U-937 и Jurkat, а также в контрольной ДНК клеточной линии фибробластов L-68. BlsI- и GlaI-ПЦР анализ показал, что регуляторные области генов-онкосупрессоров RASSF1A, SEPT9b, IGFBP3, CEBPD и MGMT могут как содержать метилированные последовательности 5’-R(5mC)GY-3’, так и не иметь этих сайтов в зависимости от малигнантной клеточной линии, из которой выделялась ДНК. В ДНК исследованных клеточных линий наблюдались различные комбинации генов-онкосупрессоров с метилированными сайтами. При этом в здоровых клетках линии фибробластов L-68 не было обнаружено сайтов 5’-R(5mC)GY-3’ ни в одной из упомянутых регуляторных областей. На основе полученных результатов предлагается применять BlsI- и GlaI-ПЦР анализ для эпигенетического типирования малигнантных клеточных линий.
MteI-ПЦР анализ – новый метод определения статуса метилирования GC-богатых регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека
- Категория: Эпигенетика
- Просмотров: 12407
Предложен новый метод MteI-ПЦР-анализа GC-богатых участков ДНК, основанный на уникальной метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазе MteI, имеющей протяженный высокометилированный сайт узнавания. Метод включает гидролиз ДНК ферментом MteI с последующим проведением ПЦР либо в реальном времени, либо с определением полученных продуктов метод гель-электрофореза. Установлен статус метилирования регуляторных участков ряда генов-онкосупрессоров методом MteI-ПЦР-анализа в сравнении с ранее предложенным методом BlsI- и GlaI-ПЦР-анализа. Показана применимость метода MteI-ПЦР-анализа для анализа статуса метилирования регуляторных участков генов CEBPD, HS3ST2, RASSF1A, SEPT9b и TWIST1. В случае гена RASSF1A real-time MteI-ПЦР анализ, в отличие от real-time GlaI- и BlsI-ПЦР анализа, не показывает метилирования данного участка ДНК в контрольных здоровых клетках линии фибробластов легких. Таким образом, MteI-ПЦР анализ позволяет более четко определять и дискриминировать статус метилирования регуляторного участка гена RASSF1A и, вероятно, других GC-богатых участков ДНК человека.
BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК
- Категория: Эпигенетика
- Просмотров: 13690
Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. – 2010. – Т. 6 – № 1 – С. 5-12
На основе уникальных метилзависимых сайт-специфических ДНК эндонуклеаз предложен новый метод BlsI- и GlaI-ПЦР-анализа метилированных участков ДНК. Метод включает обработку ДНК ферментами BlsI или GlaI, соответственно, с последующим ПЦР-анализом полученных гидролизатов. На примере изучения метилирования регуляторных областей ряда генов-онкосупрессоров человека показана эффективность нового метода и соответствие получаемых с его помощью результатов данным бисульфитного секвенирования ДНК. Исследование метилирования промоторной области гена DAPK1, района промотора и первого экзона гена RARB и области первого экзона гена RASSF1A новым методом выявило различные картины метилирования этих участков ДНК в клеточных линиях HeLa, Raji, U-937, Jurkat и контрольных клетках L-68. GlaI-ПЦР-анализ определил метилирование регуляторной области гена RARB в ДНК всех малигнантных клеточных линий и отсутствие этой модификации в ДНК клеток L-68. BlsI- и GlaI-ПЦР-анализ района первого экзона гена RASSF1A показал наличие метилированных участков ДНК только в клетках Raji и Jurkat. BlsI-ПЦР-анализ промоторной области гена DAPK1 продемонстрировал дополнительное метилирование этого участка ДНК только в клетках Raji. Обсуждаются возможности использования BlsI- и GlaI-ПЦР-анализа для выявления малигнантных клеток и определения типа онкопатологии.
Подробнее: BlsI- и GlaI- ПЦР анализ – новый метод исследования метилированных участков ДНК