Главная  //  Научные статьи  //  Исследование свойств ферментов  //  BstKTI – новый dam-чувствительный неошизомер эндонуклеазы рестрикции MboI, способный гидролизовать полуметилированный субстрат

BstKTI – новый dam-чувствительный неошизомер эндонуклеазы рестрикции MboI, способный гидролизовать полуметилированный субстрат

 

А.Н. Надеев, В.А.Чернухин, О.О. Севастьянова, Ю.Э. Томилова, Н.М. Шинкаренко, А.А. Евдокимов, С.Х. Дегтярев

Биотехнология, 2006, №2, с. 5-10

 

Обнаружен штамм Bacillus stearothermophilus KT, являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции BstKTI, которая является неошизомером рестриктазы MboI, узнающей последовательность 5’-↑GATC-3’. Получен препарат фермента и изучены его свойства, включая субстратную специфичность и место расщепления ДНК. Показано, что гидролиз ДНК осуществляется в положении 5’-GAT↑C-3’. В отличии от других изошизомеров рестриктазы MboI, BstKTI является чувствительным к dam-метилированию, но способен расщеплять полуметилированный по аденину субстрат. Кроме того, BstKTI гидролизует сайт 5’-GATC-3’, в котором цитозин модифицирован в положении С5.

 

Эндонуклеазы рестрикции узнающие и гидролизующие последовательность двуцепочечной ДНК, 5’-GATC-3’, были открыты около тридцати лет назад. В настоящее время описано значительное количество ферментов, различающихся как местом гидролиза, так и чувствительностью к метилированию данного сайта узнавания. Среди известных изошизомеров рестриктазы MboI существуют ферменты чувствительные (то есть не способные расщеплять ДНК) к модификации в сайте узнавания, как аденина (называемые dam-чувствительными), так и цитозина [1]. Это свойство находит различные применения. Например, чувствительность к модификации аденинового остатка позволяет использовать такие ферменты для определения dam-метилирования ДНК и оценки степени такой модификации [2]. Наряду с этим разработан метод получения крупных фрагментов ДНК с помощью рестриктазы MboI, который может быть использован для конструирования геномных библиотек. Этот метод основан на частичном dam-метилировании геномной ДНК.
Среди рестриктаз узнающих последовательность 5’-GATC-3’ наиболее часто встречаются изошизомеры MboI, расщепляющие обе цепи ДНК перед гуанином. В настоящее время в литературе описаны и другие неошизомеры MboI. Среди них рестриктаза BspKT6I с неясным местом расщепления [3,4] и рестриктаза ChaI, расщепляющая ДНК по сайту узнавания, в положении 5’-GATC↑-3’ [5].
Статья посвящена выделению и анализу биохимических свойств нового неошизомера MboI, рестриктазы BstKTI, гидролизующей ДНК в положении 5’-GAT↑C-3’.

 

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Для получения препарата эндонуклеазы рестрикции BstKTI клетки B.stearothermophilus KT выращивали в ферментере (New Brunswick, США) при температуре 37°С. Бульон содержал 1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт (Organotechnie, Франция), 0,5% NaCl, 0,05% MgCl2 и 0,001% тиамин. Культуру выращивали в течение 4 ч до ОП550 =1.8, при 55°С, pH 7,5, аэрации воздухом 10 л/мин. Клетки (65 г) осаждали центрифугированием при 8000 об/мин и замораживали.
Выделение фермента BstKTI проводили при 4°С с использованием растворов: буфер А - 10 мМ Трис-HCl pH 7,6, 0,1 мМ ЭДТА и 7 мМ 2-меркаптоэтанол, буфер B - 50 мМ Трис-HCl pH 7,6, 0,1 мМ ЭДТА и 7 мМ 2-меркаптоэтанол. Биомассу клеток (20 г) суспендировали в 40 мл буфера А с добавлением 0,4 М NaCl, 1мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,1 мг/мл лизоцима, 0,1% Тритона Х-100. Клетки разрушали ультразвуком на Soniprep 150 (“MSE”, Англия) с диаметром адаптера 2 см. Обработку проводили при амплитуде 20 мкм 7 раз по 1 мин с интервалами по 1 мин, охлаждая суспензию в ледяной бане. Экстракт осветляли при 15000 об/мин 30 мин в роторе JA-20 на центрифуге J2-21 (“Bеckman”, США). Экстракт объемом 40 мл наслаивали на колонку с биогелем А 0,5М (“Bio-Rad”, США, V=500 мл) и проводили элюцию со скоростью 40 мл/ч. Далее осуществляли последовательную хроматографическую очистку на фосфоцеллюлозе Р-II (“Whatman”, Англия), бензил-ДЭАЭ целлюлозе (“Sigma”, США) с использованием буфера А и на фенил-агарозе (“Sigma”, Германия) с использованием буфера В.
Оптимальные условия проявления активности рестриктазы BstKTI определяли путем гидролиза ДНК фага λ в пяти стандартных буферных растворах [6] (буфер №1 (В): 10мМ трис HCl, pH 7,6 (при 25°C), 10мМ МgCl2 , 1мМ ДТТ; буфер №2 (G): 10мМ трис-HCl, pH 7,6 (при 25°C), 10мМ МgCl2 ,50 мМ NaCl, 1мМ ДТТ; буфер №3 (O): 50мМ трис-HCl, pH 7,6 (при 25°C), 10мМ МgCl2 ,100 мМ NaCl, 1мМ ДТТ; буфер №4 (W): 10мМ трис-HCl, pH 8,5 (при 25°C), 10мМ МgCl2 ,100 мМ NaCl, 1мМ ДТТ; буфер №5 (Y): 33мМ трис-ацетат, pH 7,9 (при 25°C), 10мМ ацетат магния , 66мМ ацетат калия, 1мМ ДТТ) в течение 1ч при температурах 37°С и 55°С. Продукты гидролиза разделяли в 1% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и фотографировали гель в УФ-свете. Для определения активности BstKTI, в реакционную смесь, прогретую при 37°С и содержащую 1 мкг ДНК фага λ в 50 мкл буфера SE-4(«W») последовательно добавляли 0,5, 1, 2 мкл фермента и проводили гидролиз при 37°С в течение 1 часа. Реакцию останавливали добавлением к каждой пробе по 5 мкл смеси для остановки реакции - 0,05%-ный бромфеноловый синий, 50% глицерин, 0,1 М ЭДТА. Электрофорез проводили в 1% агарозном геле в течение 1 часа при 200 мА в трис-ацетатном буфере рН 8,0. За единицу активности (ед. акт.) принимали количество фермента, достаточное для полной фрагментации 1 мкг ДНК фага λ за 1 час при 37°С в буфере SE-4(«W»).
Отсутствие примесей неспецифических эндонуклеаз, в препарате рестриктазы BstKTI, выявляли путем инкубирования 1 мкг ДНК фага λ с 1 мкл фермента в 50 мкл реакционной смеси в буфере SE-4 («W») в течение 16 ч при 37°С. При этом картина гидролиза ДНК не отличалась от характерной для BstKTI [7]. Отсутствие примесей экзонуклеаз и фосфатаз выявляли реакциями рестрикция-лигирование-рестрикция с 2-кратным избытком фермента, а также инкубацией 2 ед. акт. фермента c 5’-32P-меченым олигонуклеотидом (20 п.о., одно- и двуцепочечным) в течение 3 ч при 37°С в буфере SE-2 («G») [8]. Пробы подвергали электрофорезу в 20% ПААГ с 8 М мочевиной. Стабильность 5’- меченого олигонуклеотида указывала на отсутствие примесных активностей.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выход биомассы составил 5 г/л. Из 50 г биомассы было получено 15000 единиц активности с концентрацией фермента 3 ед/мкл.
Максимальную активность фермент BstKTI проявлял в температурном диапазоне 46-50°С. При 37°С активность составляла 90% от максимальной, при 55°С – 80% от максимальной. Наибольшая активность фермента проявлялась в буфере №4 (W).
Для определения узнаваемой ферментом последовательности, различные фаговые ДНК полностью расщепляли рестриктазой BstKTI. Проводили сравнение полученной электрофореграммы (рис. 1) с расчитанными с помощью компьютера картинами расщепления использованных ДНК для всех известных в настоящее время рестриктаз с различными сайтами узнавания. Выяснилось, что идентичные картины гидролиза двух различных ДНК (фага λ и фага Т7) образует эндонуклеаза рестрикции MboI, узнающая палиндромную последовательность нуклеотидов 5’-GATC-3’. Исследуемый фермент расщепляет только немодифицированную ДНК. Если для реакции использовать dam-метилированную ДНК, например ДНК фага λ (рис. 1, дорожка 4), то гидролиз не наблюдается. Таким образом, BstKTI является чувствительным к dam-метилированию.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper39_fig1.jpg

 

 

Рис. 1. Электрофоретическая картина гидролиза ДНК рестриктазой BstKTI в 1% агарозном геле.
1, 5 - маркеры (гидролизат ДНК фага λ рестриктазой Bme18I);
2 - немодифицированная ДНК фага λ, обработанная рестриктазой BstKTI;
3 - немодифицированная ДНК фага Т7, обработанная рестриктазой BstKTI;
4 - ДНК фага λ, модифицирована dam-метилазой и обработанная рестриктазой BstKTI.

 

 


Место гидролиза ДНК рестриктазой BstKTI определяли с использованием синтетического олигонуклеотидного дуплекса, содержащего последовательность, узнаваемую ферментом. Использовали олигонуклеотиды следующей структуры:

 

№1: 5’-ACCTTGATCAGGACCTCGAGGATAC-3’
№2: 5’-GTATCCTCGAGGTCCTGATCAAGGT-3’



Одну из цепей дуплекса метили с 5’ конца при помощи Т4-полинуклеотидкиназы и [γ32P]dATP. Продукты гидролиза разделяли в 20%-ном полиакриламидном денатурирующем геле с 8М мочевиной и получали радиоавтограф, который приведен на рис. 2. Как видно из этого рисунка, BstKTI гидролизует последовательность 5’-GATC-3’ перед цитозином.
Мы исследовали способность фермента BstKTI гидролизовать сайты 5'-GATC-3', в которых метилирован аденин или цитозин в положении С5. Неспособность BstKTI расщеплять сайты, в которых модифицирован аденин следует из отсутствия гидролиза данным ферментом ДНК фага λ (рис. 1), а также других dam-метилированных субстратов, например, хромосомной ДНК бактериального штамма Thermus ruber 9 (рис. 3а), являющегося продуцентом изошизомера MboI, рестриктазы Tru9II [6]. Модификация аденина в хромосомной ДНК штамма T.ruber 9 в обеих цепях по сайту 5'-GATC-3’ подтверждается тем, что данная ДНК расщепляется рестриктазой MalI. Эндонуклеаза рестрикции MalI [6] является изошизомером рестриктазы DpnI, способной гидролизовать только 5'-G(mN6A)TC-3’/5'-G(mN6A)TC-3’ сайт, где (mN6A) – аденин, модифицированный в положении N6 [9].

b_320_200_16777215_00_Pics_paper39_fig2.jpg

 

Рис. 2. Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции BstKTI. Радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления олигонуклеотидного дуплекса, в котором одна из цепей (№1) мечена фосфором 32P по 5’-концу. γ32P меченные олигонуклеотиды, обозначены знаком *.
1 – исходный дуплекс 1*/2;
2 – дуплекс, обработанный рестриктазой Kzo9I;
3 – дуплекс, обработанный экзонуклеазой ExoIII;
4 – дуплекс, обработанный рестриктазой BstKTI.

 

 

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper39_fig3.jpg

 

 

Рис. 3. Гидролиз хромосомных ДНК из бактериальных штаммов T.ruber 9 (a) и K.zopfii 9 (б).
1 - исходная хромосомная ДНК T.ruber 9 (a) и K.zopfii 9 (б);
2 - хромосомная ДНК, обработанная рестриктазой MalI;
3 - хромосомная ДНК, обработанная рестриктазой Kzo9I;
4 - хромосомная ДНК, обработанная рестриктазой BstKTI, 5 - маркер (гидролизат ДНК фага λ рестриктазой Bme18I).

 

 


Исследуемый фермент не чувствителен к модификации цитозина в сайте узнавания в положении C5. Это подтверждается его способностью расщеплять хромосомную ДНК из бактериального штамма Kurthia zopfii 9, в которой сайты 5'-GATC-3’ модифицирован в положение С5 (рис. 3б). Данный штамм является продуцентом эндонуклеазы рестрикции Kzo9I. Как видно из рисунка, хромосомная ДНК K.zopfii 9 не гидролизуется только рестриктазой MalI, что означает, что она не модифицирована по аденину.
Чувствительность исследуемого фермента к модификации в сайте узнавания аденина и цитозина в положении С5, а так же способность расщеплять полуметилированный по аденину субстрат, проверялась на синтетических олигонуклеотидных дуплексах, составленные из следующих олигонуклеотидов:

 

№3: 5'-GTCGTGCGATCGCGTACGTTTG-3'
№4: 5'-CAAACGTACGCGATCGCACGAC-3'
№5: 5'-GTCGTGCG(N6mA)TCGCGTACGTTT G-3'
№6: 5'-CAAACGTACGCG(N6mA)TCGCACGAC-3'
№7: 5'-GTCGTGCGAT(5mC)GCGTACGTTTG-3'
№8: 5'-CAAACGTACGCGAT(5mC)GCACGAC-3',
где 5mC - цитозин, метилированный в положении 5.


На рис.4 представлен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления олигонуклеотидного дуплекса, в котором одна из цепей мечена по 5’-концу γ32P. Как видно из данного рисунка, BstKTI расщепляет ДНК, в которой в сайте узнавания обе цепи неметилированы (дорожка 2), в одной из цепей метилирован аденин (дорожки 4, 6), в обеих цепях метилирован цитозин (дорожка 8); одновременно с этим фермент не способен расщеплять ДНК, если в сайте узнавния обе цепи модифицированны по аденину (дорожка 10). Из этих данных можно сделать вывод о том, что BstKTI обладает комбинацией свойств, связанных с чувствительностью к модификации сайта узнавания. Фермент, будучи dam-чувствительным, способен гидролизовать полуметилированный субстрат.

 

b_320_200_16777215_00_Pics_paper39_fig4.jpg

Рис. 4. Радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления олигонуклеотидного дуплекса, в котором одна из цепей мечена фосфором 32P по 5’-концу. Время гидролиза 1 час. Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором 32P по 5'-концу, обозначены знаком *.
1 – исходный дуплекс 3*/4 (неметилированный сайт); 2 – дуплекс 3*/4, обработанный 1 ед. акт. рестриктазы BstKTI;
3 – исходный дуплекс 4*/5 (полуметилированный по аденину сайт); 4 – дуплекс 4*/5, обработанный 1 ед. акт. рестриктазы BstKTI (гидролиз неметилированной цепи);
5 – исходный дуплекс 5*/4 (полуметилированный по аденину сайт); 6 – дуплекс 5*/4, обработанный 1 ед. акт. рестриктазы BstKTI (гидролиз метилированной цепи);
7 – исходный дуплекс 7*/8 (полностью метилированный по цитозину сайт в положении С5); 8 – дуплекс 7*/8, обработанный 1 ед. акт. рестриктазы BstKTI;
9 – исходный дуплекс 5*/6 (полностью метилированный по аденину сайт); 10 – дуплекс 5*/6, обработанный 1 ед. акт. рестриктазы BstKTI.


Следует отметить, что в настоящее время неизвестно других dam-чувствительных ферментов, которые могли бы с высокой эффективностью расщеплять полуметилированный по аденину сайт 5’-GATC-3’. Хотя существует изошизомер MboI, рестриктаза Sau3AI, которая способна гидролизовать полуметилированный по аденину сайт 5’-GATC-3’, но этот фермент не является dam-чувствительным, поскольку, способен расщеплять и полностью модифицированный по аденину сайт 5’-GATC-3’ [1]. Кроме того, Sau3AI в отличие от BstKTI является чувствительным к метилированию цитозина в положении С5: он не способен расщеплять как полностью модифицированный по цитозину сайт, так и полуметилированный [1]. Данные по чувствительности к метилированию рестриктаз прототипа MboI приведены в таблице 1.
Защита от гидролиза хозяйской ДНК продуцентов эндонуклеаз рестрикции может осуществляться ДНК-метилтрансферазами трех типов: модифицирующих цитозин в положении N4 или С5, или модифицирующих аденин в положении N6 [10]. Для того, чтобы выяснить с помощью какого типа модификации ДНК по сайту 5’-GATC-3’ осуществляется защита от собственной рестриктазы BstKTI в штамме B.stearothermophilus KT, мы провели гидролиз хромосомной ДНК из данного штамма рестриктазами MalI, Kzo9I и BamHI (рис. 5). Как видно из рисунка, хромосомная ДНК гидролизуется MalI, что свидетельствует о том, что ДНК dam-метилирована. Гидролиз хромосомной ДНК эндонуклеазами рестрикции Kzo9I и BamHI, которые блокируются модификацией цитозина в сайте 5'-GATC-3' в положении С5 и N4 соответственно, свидетельствует об отсутствии модификации цитозина в данной хромосомной ДНК. Отсутствие гидролиза ферментом BstKTI объясняется dam-модификацией ДНК.

b_320_200_16777215_00_Pics_paper39_fig5.jpg

 

 

Рис. 5. Гидролиз хромосомной ДНК из бактериального штамма B.stearothermophilus KT.
1, 7 - маркер (гидролизат ДНК фага λ рестриктазой Bme18I);
2 - исходная хромосомная ДНК B.stearothermophilus KT;
3 - хромосомная ДНК, обработанная рестриктазой BstKTI;
4 - хромосомная ДНК, обработанная рестриктазой BamHI;
5 - хромосомная ДНК, обработанная рестриктазой MalI;
6 - хромосомная ДНК, обработанная рестриктазой Kzo9I.


Нами показано, что в штамме B.stearothermophilus KT, являющимся продуцентом эндонуклеазы рестрикции BstKTI, хозяйская ДНК dam-модифицирована. На сегодня не известно как осуществляется защита хозяйской ДНК в пострепликативный период, когда хромосомная ДНК преимущественно полуметилирована. Этот вопрос требует дальнейшего исследования, и по-видиму связан с системой жесткой регуляции экспрессии гена эндонуклеазы рестрикции.
Способность BstKTI расщеплять полуметилированный по аденину субстрат одновременно с чувствительностью к dam-метилированию может иметь различные применения в биотехнологии. Данное свойство может быть использованно для детекции полуметилированной ДНК, например, при исследовании процесса репликации, полимеразной цепной реакции первоначально dam-метилировнной ДНК и т.д. Кроме того, фермент BstKTI может применяться для направленного гидролиза сайтов 5’-GATC-3’ на dam-модифицированной субстратной ДНК.
Благодаря довольно высокому содержанию фермента в клетках штамма продуцента, BstKTI представляет интерес как для научных исследований, так и для практического применения.

 

ЛИТЕРАТУРА

  1. Hermann, A., Jeltsch, A. // Biotechniques.— 2003. — V.34. — P. 924-930.
  2. Dreiseikelmann, B., Eichenlaub, R., Wackernagel, W. // Biochim. Biophys. Acta. — 1979. — V. 562. — P. 418-428.
  3. Shapovalova, N.L., Zheleznaja, L.A., Matvienko, N.L. // Nucleic Acids Res. — 1993. — V. 21 — P. 5794.
  4. Шаповалова Н.Л., Жедезная Л.А., Матвиенко Н.Л. // Биохимия. — 1994. — Т. 59 — С. 1730-1738.
  5. Roberts, R.J., Macelis, D. // Nucleic Acids Res. — 1996. — V. 24. — P. 223-235.
  6. Каталог СибЭнзим. http://www.sibenzyme.com.
  7. Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И. // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук. — 1998. — В. 2. — С. 102-105.
  8. New England Biolabs. Catalog. NEB Inc. USA. p. 12. (2002)
  9. Lacks, S.A. // Methods Enzymol. — 1980. — V. 65. — P. 138-146.
  10. Gromova, E.S., Khoroshaev, A.V. // Mol. Biol. — 2003. — V. 37. — P. 300-314.