Научные статьи // Исследование свойств ферментов
Субстратная специфичность новой ДНК-эндонуклеазы GlaI
- Категория: Исследование свойств ферментов
- Просмотров: 10526
BMC Molecular Biology 2008, 9:7 - на английском языке
Ранее нами были обнаружены сайт-специфические эндонуклеазы, расщепляющие только последовательности ДНК, содержащие 5-метилцитозин. Две специфичности таких эндонуклеаз были описаны. Ферменты BisI, BlsI и GluI являются изошизомерами и гидролизуют последовательность ДНК 5’-GCNGC-3', которая полностью или частично метилирована с образованием 5-метилцитозинов. Фермент GlaI узнает 5’- GС↑GC-3’, если два, три или четыре ее цитозиновых основания метилированы. Целью данной работы стало изучение влияния нуклеотидной последовательности и метилирования цитозиновых оснований в сайте узнавания на эффективность гидролиза ДНК ферментом GlaI. В предыдущей работе мы изучали зависимость активности GlaI от количества и положения 5-метилцитозинов в сайте узнавания фермента 5'-GCGC-3'/3'-CGCG-5'. Значительный гидролиз ДНК наблюдался для олигонуклеотидных дуплексов, содержащих три или четыре 5-метилцитозина. В данной работе предметом нашего изучения стала зависимость активности GlaI от количества и положения метилированных цитозинов, а также от состава узнаваемой последовательности. В список хороших субстратов для GlaI мы включили полностью метилированный сайт 5’-GMGM-3’/3’-MGMG-’, сайты с тремя метилированными цитозинами 5’-PuМGМ-3’/3’-PyGМG-5’ и одну последовательность узнавания с двумя 5-метилцитозинами 5’-AМGT-3’/3’-TGМA-5’. GlaI субстраты со средней активность представлены сайтами с тремя метилированными цитозинами и общей структурой 5’-GМPuМ-3’/3’-МGPyG-5’, а также сайтами с двумя 5-метилцитозинами 5’-PuМGT-3’/3’-PyGМA-5’. Сайт 5’-GМGC-3’/3’-CGМG-5’ можно считать плохим субстратом для GlaI.
Подробнее: Субстратная специфичность новой ДНК-эндонуклеазы GlaI
BstKTI – новый dam-чувствительный неошизомер эндонуклеазы рестрикции MboI, способный гидролизовать полуметилированный субстрат
- Категория: Исследование свойств ферментов
- Просмотров: 7945
Биотехнология, 2006, №2, с. 5-10
Обнаружен штамм Bacillus stearothermophilus KT, являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции BstKTI, которая является неошизомером рестриктазы MboI, узнающей последовательность 5’-↑GATC-3’. Получен препарат фермента и изучены его свойства, включая субстратную специфичность и место расщепления ДНК. Показано, что гидролиз ДНК осуществляется в положении 5’-GAT↑C-3’. В отличии от других изошизомеров рестриктазы MboI, BstKTI является чувствительным к dam-метилированию, но способен расщеплять полуметилированный по аденину субстрат. Кроме того, BstKTI гидролизует сайт 5’-GATC-3’, в котором цитозин модифицирован в положении С5.
Подробнее: BstKTI – новый dam-чувствительный неошизомер эндонуклеазы рестрикции MboI, способный...
ДНК-метилтрансфераза FauIA, модифицирующая второй остаток цитозина в непалиндромной последовательности 5'-CCCGC-3' (выделение и свойства)
- Категория: Исследование свойств ферментов
- Просмотров: 6797
Биохимия том 70 вып. 6, 2005, 829 - 837
Ген ДНК-метилтрансферазы FauIA из системы рестрикции–модификации FauI (сайт узнавания 5'-CCCGC-3') был клонирован в экспрессирующий вектор pJW, который использовался для трансформации клеток E.coli RR1 с последующей термоиндукцией и наработкой биомассы бактериальных клеток. Высоко очищенный препарат ДНКметилтрансферазы – М.FauIA, был получен с помощью хроматографии на различных носителях. Выделенный фермент имеет молекулярный вес ~39 кДа, что соответствует теоретически установленному молекулярному весу соответствующей рамки трансляции. Изучение свойств полученного фермента показало, что М.FauIA имеет температурный оптимум 33° и проявляет максимальную активность при pH 7,5. Метилированием ферментом М.FauIA синтетического олигонуклеотида с последующим расщеплением различными рестриктазами и анализом полученных продуктов установлено, что М.FauIA модифицирует второй цитозин в последовательности 5-'CCCGC3-'. Определены кинетические параметры реакции метилирования синтетического олигонуклеотидного дуплеска ферментом М.FauIA и показано, что константа Михаэлиса (Km) для этого субстрата составляет 0,16 мкМ, Km для S-аденозил-L-метионина (SAM) равно 0,78 мкМ, а значение каталитической константы (kkat) составило 0,05 мин–1.
Подробнее: ДНК-метилтрансфераза FauIA, модифицирующая второй остаток цитозина в непалиндромной...
Зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов в узнаваемой последовательности 5’-GCGC-3’.
- Категория: Исследование свойств ферментов
- Просмотров: 7625
Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, 2006, т.2, №1, с. 30-39.
Изучена зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI, узнающей и гидролизующей метилированную последовательность ДНК 5’-GCGC-3’/3’-CGCG-5’, от количества и положения метилированных по 5-ому положению цитозиновых остатков в последовательности узнавания. Существенный гидролиз ДНК происходит только в том случае, если в сайте узнавания модифицировано от двух до четырех оснований, причем в первом случае оба метилцитозина должны быть внутренними. Эффективность расщепления субстрата возрастает с увеличением количества метилированных оснований и максимальна, когда в сайте узнавания модифицированы все четыре цитозина. GlaI расщепляет сайты, содержащие 5-метилцитозины, но не N4-метилцитозины.