 | |
| Определение эндонуклеаз рестрикции в колониях микроорганизмов Streptomyces и Nocardia |
|
| | Предложен метод тестирования различных штаммов актиномицетов Streptomyces и Nocardia на наличие эндонуклеаз рестрикции. Тестирование проводилось непосредственно в клетках из колоний с чашки Петри. Собранные клетки обрабатывали лизоцимом и тритоном Х-100, после чего клеточный лизат анализировали на наличие специфической эндонуклеазной активности. Метод позволяет тестировать ферменты NcoI, NotI, NruI, SfiI, Sfr303I в лизатах соответствующих штаммов-продуцентов. | |
|
|
| |
| |
| Выявление штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикций среди водных микроорганизмов озера Байкал |
|
| | Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) находят широкое применение в генно-инженерных работах [1, 2], что обусловливает актуальность выявления новых штаммов-продуцентов этих ферментов, являющихся более технологичными, чем известные.
Поиск новых штаммов-продуцентов рестриктаз проводится среди микроорганизмов, выделенных из различных природных изолятов. Водные микроорганизмы относительно плохо изучены как возможные продуценты рестриктаз, хотя среди них недавно были выявлены ферменты с новой специфичностью [3, 4].
Целью данной работы явились обнаружение и идентификация новых штаммов-продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов уникальной экологической ниши — оз. Байкал.
Изолированность экосистемы Байкала, установленная в настоящее время, обеспечивает благоприятные условия для образования новых видов организмов. Поскольку хорошо известно, что при прочих равных условиях скорость эволюции вида обратно пропорциональна продолжительности генерации [5], то очевидна целесообразность поиска эндемичных видов и, следовательно, продуцентов новых ферментов среди байкальских микроорганизмов, т. е. штаммов, выделенных из пелагиальной части водной толщи и донных отложений.
| |
|
|
| |
| |
| Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции |
|
| | Предложен метод аффинной хроматографии эндонуклеаз рестрикции IIS-типа. Показано, что рестриктазы HgaI, FokI, SfaNI избирательно связываются на носителе с иммобилизованным дуплексом (один из олигонуклеотидов которого ковалентно связан с полимерным носителем), содержащим сайты узнавания этих ферментов, но неспособным гидролизоваться ими. | |
|
|
| |
| |
| Модифицированный способ определения места расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции |
|
| | Успехи молекулярной биологии и генетической инженерии во многом определяются наличием широкого ассортимента эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз), список которых ежегодно пополняется новыми наименованиями [1]. Обнаруживаемые ферменты необходимо охарактеризовать как по узнаваемой ими последовательности, так и по месту расщепления цепи ДНК. Идентификация сайта узнавания в настоящее время не представляет проблемы. С этой целью обычно используют совместный гидролиз ДНК изучаемыми ферментами и ферментами известной специфичности [2—4] либо сравнивают экспериментальные данные с предполагаемыми картинами расщепления маркерной ДНК по сайтам узнавания [5—8]. | |
|
|
| |
| |
| Определение чистоты препаратов эндонуклеаз рестрикции |
|
| | В начале 70-х годов были открыты первые эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), а сегодня уже налажен выпуск широкого ассортимента этих ферментов для использования в генно-инженерных работах. Одной из важнейших характеристик производимых препаратов ферментов является их чистота от примесных активностей, в частности от примесей нуклеаз и фосфатаз. | |
|
|
| |
| |
| Поиск штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди почвенных микроорганизмов |
|
| | Возникновение генетической Инженерии и ее успехи в значительной мере связаны с открытием эндонуклеаз рестрикции [1], Эти ферменты широко используются в решении прикладных задач и служат объектом фундаментальных исследований, касающихся белок-нуклеиновых взаимодействий [1—3]. Наряду с этим, актуальным является изучение биосинтеза рестриктаз [4].
Целью данной работы явилось выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди почвенных микроорганизмов, а также оптимизация культивирования одного из них.
| |
|
|
| |
| |
| Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий |
|
| | Предложен метод тестирования бактериальных штаммов на наличие эндонуклеаз рестрикции. Анализ проводится непосредственно в клетках из колоний с чашки Петри. Собранные клетки обрабатывают лизоцимом и тритоном Х-100 и после центрифугирования супернатант анализируют на наличие специфической эндонуклеазной активности. Метод позволяет за 3—4 ч провести анализ до 100 колоний. | |
|
|
| |
| |
| Расщепление ДНК, адсорбированной на поверхности фосфолипидных мембран, рестриктазами типа II |
|
| | Изучен гидролиз ДНК фага λ рестриктазами типа II в присутствии модельных мембран из яичного фосфатидилхолина. Показано, что степень гидролиза ДНК ферментами BspI, PstI и BamHI в этих условиях резко снижена. Это не связано с необратимой инактивацией ферментов или их взаимодействием с мембраной. Наиболее вероятное объяснение ингибирования гидролиза ДНК в присутствии фосфолипидных везикул - изменение субстратных свойств ДНК в результате ее адсорбции на поверхности фосфолипидной мембраны при участии ионов Mg2+. | |
|
|
| |
| |
