 | |
| Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК мыши in vitro и in silico |
|
| | На основе ранее предложенного метода рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico рассчитаны диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК мыши при ее расщеплении по 18 нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. Проведен анализ имеющихся в базе данных нуклеотидных последовательностей LINE1 повторов мыши и фрагментов ДНК, образующихся при расщеплении этих повторов. Установлено, что абсолютное большинство пиков на диаграммах расщепления хромосомной ДНК соответствуют аналогичным пикам, образуемым при расщеплении множества LINE1 повторов ДНК мыши по тем же нуклеотидным последовательностям. Получены экспериментальные картины гидролиза ДНК мыши соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Проведено сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов и полученных картин гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции. Показано, что при анализе препаратов ДНК с помощью электрофореза в геле визуализируются только продукты расщепления LINE1-повторов и γ-сателлитной ДНК мыши. Проделаны эксперименты по гидролизу хромосомной ДНК мыши 5-метилцитозин-зависимыми сайт-специфическими эндонуклеазами BlsI, GlaI и GluI. | |
|
|
| |
| |
| Физическая карта расщепления эндонуклеазами рестрикции Alu повторов человека |
|
| | В человеческом геноме содержится большое число Alu-повторов. Разнообразие нуклеотидных последовательностей этих элементов затрудняет получение теоретических картин расщепления Alu-повторов эндонуклеазами рестрикции. Нами предложен метод рестрикционного анализа Alu-повторов in silico.
Для анализа Alu-повторов и получения картин расщепления по сайтам узнавания нескольких эндонуклеаз рестрикции было использовано простое программное обеспечение. Построены рестрикционные карты Alu-повторов для соответствующих ферментов. Теоретические данные сравнивались с экспериментальными результатами гидролиза ДНК ферментами рестрикции, полученными ранее.
Расщепление Alu-повторов вносит основной вклад в картины расщепления, получаемые при расщеплении геномной ДНК человека. Это соответствует экспериментальным данным по гидролизу суммарной ДНК человека эндонуклеазами рестрикции. | |
|
|
| |
| |
| Субстратная специфичность новой ДНК-эндонуклеазы GlaI |
|
| | Ранее нами были обнаружены сайт-специфические эндонуклеазы, расщепляющие только последовательности ДНК, содержащие 5-метилцитозин. Две специфичности таких эндонуклеаз были описаны. Ферменты BisI, BlsI и GluI являются изошизомерами и гидролизуют последовательность ДНК 5’-GCNGC-3', которая полностью или частично метилирована с образованием 5-метилцитозинов. Фермент GlaI узнает 5’- GС^GC-3’, если два, три или четыре ее цитозиновых основания метилированы.
Целью данной работы стало изучение влияния нуклеотидной последовательности и метилирования цитозиновых оснований в сайте узнавания на эффективность гидролиза ДНК ферментом GlaI.
В предыдущей работе мы изучали зависимость активности GlaI от количества и положения 5-метилцитозинов в сайте узнавания фермента 5'-GCGC-3'/3'-CGCG-5'. Значительный гидролиз ДНК наблюдался для олигонуклеотидных дуплексов, содержащих три или четыре 5-метилцитозина. В данной работе предметом нашего изучения стала зависимость активности GlaI от количества и положения метилированных цитозинов, а также от состава узнаваемой последовательности.
В список хороших субстратов для GlaI мы включили полностью метилированный сайт 5’-GMGM-3’/3’-MGMG-’, сайты с тремя метилированными цитозинами 5’-PuМGМ-3’/3’-PyGМG-5’ и одну последовательность узнавания с двумя 5-метилцитозинами 5’-AМGT-3’/3’-TGМA-5’.
GlaI субстраты со средней активность представлены сайтами с тремя метилированными цитозинами и общей структурой 5’-GМPuМ-3’/3’-МGPyG-5’, а также сайтами с двумя 5-метилцитозинами 5’-PuМGT-3’/3’-PyGМA-5’.
Сайт 5’-GМGC-3’/3’-CGМG-5’ можно считать плохим субстратом для GlaI. | |
|
|
| |
| |
| Новая сайт-специфическая эндонуклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)^NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN^(5mC)G-5’. |
|
| | Из бактериального штамма Glacial ice bacterium GL24 была выделена и охарактеризована новая сайт-специфическая эндонуклеаза GluI. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)^NG(5mC)-3’/3’-(5mC)GN^(5mC)G-5’ расщепляет ее, как указано стрелкой. Благодаря своей способности расщеплять только высокометилированную ДНК фермент GluI может найти практическое применение в генно-инженерных работах, а также для определения статуса метилирования ДНК эукариот. | |
|
|
| |
| |
| Рестрикционный анализ ДНК человека – новые возможности в ДНК-диагностике |
|
| | Изучены возможности использования метода расщепления хромосомной ДНК человека эндонуклеазами рестрикции в работах по медицинской генетике. На основе ранее опубликованной работы по анализу геномов млекопитающих in silico рассчитаны диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК человека при ее расщеплении по 15 нуклеотидным последовательностям, которые являются сайтами узнавания рестриктаз. Проведен анализ первичной структуры Alu- и LINE1-повторов ДНК и построены диаграммы распределения фрагментов ДНК повторов при ее расщеплении по этим 15 нуклеотидным последовательностям. При этом показано, что диаграммы распределения получаемых низкомолекулярных фрагментов хромосомной ДНК соответствуют диаграммам распределения фрагментов Alu-повторов, тогда как картины распределения высокомолекулярных фрагментов аналогичны диаграммам распределения LINE1-повторов. Получены картины гидролиза ДНК человека соответствующими эндонуклеазами рестрикции и проведено сравнение теоретических диаграмм распределения фрагментов и экспериментально полученных результатов. Обсуждаются перспективы применения сайт-специфических эндонуклеаз в ДНК-диагностике. | |
|
|
| |
| |
| Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательность ДНК 5’-G(5mC)N^GC-3’ и расщепляет ее с образованием 3’-выступающих концов |
|
| | Из природных изолятов выделен бактериальный штамм Bacillus simplex 23, продуцент сайт-специфической эндонуклеазы BlsI. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)N^GC-3’, как и обнаруженная ранее сайт-специфическая эндонуклеаза BisI (сайт узнавания 5’-G(5mC)^NGC-3’), но, в отличие от последней, расщепляет ДНК с образованием однонуклеотидных 3’-выступающих концов. Благодаря своей способности расщеплять только метилированную ДНК фермент BlsI может найти практическое применение в генно-инженерных работах, а также для определения статуса метилирования ДНК эукариот. | |
|
|
| |
| |
| Новая эндонуклеаза рестрикции AluBI из Arthrobacter luteus B- изошизомер AluI, нечувствительный к присутствию 5-метилцитозина в сайте узнавания AGCT |
|
| | Описаны свойства новой эндонуклеазы рестрикции, AluBI, узнающей и расщепляющей последовательность AGCT и являющейся изошизомером хорошо известной рестриктазы AluI. Фермент AluBI, в отличие от AluI, расщепляет ДНК в случае, когда цитозиновые основания в сайте узнавания метилированы в положение С5. AluBI также расщепляет последовательность узнавания с одним С5-метилированным и другим N4-метилированным цитозинами, однако не расщепляет ДНК при модификации обоих цитозинов в положение N4. | |
|
|
| |
| |
| Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5’-G(5mC)^GC-3’. |
|
| | Из бактериального штамма GL29 была выделена и охарактеризована новая эндонуклеаза рестрикции GlaI. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)↓GC-3’ и расщепляет ее, как указано стрелкой. Благодаря своей способности расщеплять только метилированную ДНК GlaI может найти практическое применение в генно-инженерных работах, а также для определения статуса метилирования ДНК эукариот. | |
|
|
| |
| |
| BstKTI – новый dam-чувствительный неошизомер эндонуклеазы рестрикции MboI, способный гидролизовать полуметилированный субстрат |
|
| | Обнаружен штамм Bacillus stearothermophilus KT, являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции BstKTI, которая является неошизомером рестриктазы MboI, узнающей последовательность 5’-^GATC-3’. Получен препарат фермента и изучены его свойства, включая субстратную специфичность и место расщепления ДНК. Показано, что гидролиз ДНК осуществляется в положении 5’-GAT^C-3’. В отличии от других изошизомеров рестриктазы MboI, BstKTI является чувствительным к dam-метилированию, но способен расщеплять полуметилированный по аденину субстрат. Кроме того, BstKTI гидролизует сайт 5’-GATC-3’, в котором цитозин модифицирован в положении С5 | |
|
|
| |
| |
| Сравнительный рестрикционный анализ хромосомной ДНК крысы in vitro и in silico |
|
| | На основе ранее предложенного метода рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico рассчитаны диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК крысы при ее расщеплении по более чем 25 нуклеотидным последовательностям, являющимися сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. При проведении рестрикционного анализа in vitro получены картины электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях продуктов гидролиза ДНК крысы всеми этими ферментами. Проведено сравнение теоретически рассчитанных диаграмм распределения фрагментов и экспериментально полученных данных по гидролизу ДНК соответствующими эндонуклеазами рестрикции. | |
|
|
| |
| |
| Метод рестрикционного анализа геномов млекопитающих in silico |
|
| | Предложен метод получения теоретических картин расщепления хромосомной ДНК млекопитающих эндонуклеазами рестрикции. Основываясь на опубликованных в последнее время данных по первичной структуре геномов, проведен расчет и построены диаграммы распределения фрагментов хромосомной ДНК мыши, крысы и человека, полученных при расщеплении по последовательностям 5’-GGCC-3', 5'-CCGG-3', 5'-GATC-3' и 5'-CC(A/T)GG-3'. Проделаны эксперименты по гидролизу хромосомной ДНК эндонуклеазами рестрикции HaeIII, MspI, Kzo9I и Bst2UI, имеющими соответствующие сайты узнавания, и показано соответствие между рассчитанными диаграммами и экспериментально полученными картинами рестрикции ДНК | |
|
|
| |
| |
| Новая сайт-специфическая эндонуклеаза AbsI из Arthrobacter species 7М06 узнает октануклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-CC^TCGAGG-3’ |
|
| | Обнаружен бактериальный штамм Arthrobacter species 7М06, который является продуцентом новой сайт-специфической эндонуклеазы AbsI. Фермент AbsI узнает палиндромную октануклеотидную последовательность ДНК 5’-CC^TCGAGG-3’ и гидролизует ее после второго цитозина, образуя, таким образом, 5’-выступающие «липкие» концы, которые совместимы с концами, образующимися при гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции XhoI (5’-C^TCGAG-3’), PspXI (5’-VC^TCGAGB-3’) и SalI (5’-G^TCGAC-3’). Среди всех известных редкощепящих эндонуклеаз рестрикции AbsI является единственным ферментом, не имеющим сайтов узнавания на стандартных субстратов, таких как ДНК фагов лямбда и Т7, а также аденовирусной ДНК типа 2 | |
|
|
| |
| |
| Зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов в узнаваемой последовательности 5’-GCGC-3’. |
|
| | Изучена зависимость активности сайт-специфической эндонуклеазы GlaI, узнающей и гидролизующей метилированную последовательность ДНК 5’-GCGC-3’/3’-CGCG-5’, от количества и положения метилированных по 5-ому положению цитозиновых остатков в последовательности узнавания. Существенный гидролиз ДНК происходит только в том случае, если в сайте узнавания модифицировано от двух до четырех оснований, причем в первом случае оба метилцитозина должны быть внутренними. Эффективность расщепления субстрата возрастает с увеличением количества метилированных оснований и максимальна, когда в сайте узнавания модифицированы все четыре цитозина. GlaI расщепляет сайты, содержащие 5-метилцитозины, но не N4-метилцитозины. | |
|
|
| |
| |
| ДНК-метилтрансфераза FauIA, модифицирующая второй остаток цитозина в непалиндромной последовательности 5'-CCCGC-3' (выделение и свойства) |
|
| | Ген ДНК-метилтрансферазы FauIA из системы рестрикции–модификации FauI (сайт узнавания 5'-CCCGC-3') был клонирован в экспрессирующий вектор pJW, который использовался для трансформации клеток E.coli RR1 с последующей термоиндукцией и наработкой биомассы бактериальных клеток. Высоко очищенный препарат ДНКметилтрансферазы – М.FauIA, был получен с помощью хроматографии на различных носителях. Выделенный фермент имеет молекулярный вес ~39 кДа, что соответствует теоретически установленному молекулярному весу соответствующей рамки трансляции. Изучение свойств полученного фермента показало, что М.FauIA имеет температурный оптимум 33° и проявляет максимальную активность при pH 7,5. Метилированием ферментом М.FauIA синтетического олигонуклеотида с последующим расщеплением различными рестриктазами и анализом полученных продуктов установлено, что М.FauIA модифицирует второй цитозин в последовательности 5-'CCCGC3-'. Определены кинетические параметры реакции метилирования синтетического олигонуклеотидного дуплеска ферментом М.FauIA и показано, что константа Михаэлиса (Km) для этого субстрата составляет 0,16 мкМ, Km для S-аденозил-L-метионина (SAM) равно 0,78 мкМ, а значение каталитической константы (kkat) составило 0,05 мин–1. | |
|
|
| |
| |
| Использование рестрикционного анализа амплифицированного гена 16S РНК для идентификации микроорганизмов на примере бактериальных продуцентов термолабильной щелочной фосфатазы |
|
| | Предложен метод идентификации микроорганизмов, основанный на анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ПЦР-продукта гена 16S РНК длиной 1500 нуклеотидов. Подобран набор из 6 эндонуклеаз рестрикции (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI и RsaI), позволяющий с помощью ПДФР проводить идентификацию широкого спектра микроорганизмов.
Из природных изолятов морской воды выделены четыре штамма-продуцента термолабильной щелочной фосфатазы. Проведенный анализ ПДФР для данных штаммов в сравнении с расчетными результатами, полученными для генов 16S РНК различных микроорганизмов, позволил установить, что выявленные продуценты относятся к роду Alteromonas.
| |
|
|
| |
| |
| Новая эндонуклеаза рестрикции Bis I из Bacillus subtilis Т30 узнаёт метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)↓NGC-3’ |
|
| | Из природных изолятов выделен бактериальный штамм Bacillus subtilis Т30, продуцент новой эндонуклеазы рестрикции Bis I. Этот фермент узнает метилированную последовательность ДНК 5’-G(5mC)↓NGC-3’ и расщепляет ее, как указано стрелкой. Вследствие расщепления только модифицированной ДНК, фермент Bis I может найти широкое применение для определения метилированных участков на эукариотической ДНК. | |
|
|
| |
| |
| Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного микроорганизма Alteromonas undina P2 |
|
| | Из природных изолятов нами был выделен продуцент термолабильной щелочной фосфатазы, идентифицированной как вид бактерии Alteromonas undina P2. Описан способ очистки фермента. Определены оптимальные условия действия щелочной фосфатазы: 0.1 М глицин-NaOH pH 9.5, 10 мМ MgCl2 и 0.1 мМ ZnCl2. Фермент наиболее активен при 30оC. При 6оC уровень активности щелочной фосфатазы превышает 50% от максимальной. Прогревание ферментного препарата в течение 20 мин при 65о приводит к полной необратимой инактивации фосфатазы. | |
|
|
| |
| |
| Новая эндонуклеаза рестрикции PspXI узнает необычную последовательность днк 5’-VC^TCGAGB-3’ |
|
| | Нами обнаружен бактериальный штамм Pseudomonas species X11, который является продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции, названной PspXI. Этот фермент узнает восьминуклеотидную последовательность ДНК с необычным, V-B типом вырожденности: 5’-VCTCGAGB-3’, где V означает A, C или G, а B означает T, C или G. Препарат эндонуклеазы рестрикции PspXI с концентрацией 10000 ед/мл был получен путем очистки в четыре хроматографические стадии. Показано, что PspXI гидролизует сайт узнавания между C и T, с образованием 5’-выступающих “липких” концов, совместимых с концами, образующимися при гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции XhoI (5’-C^TCGAG-3’) и SalI (5’-G^TCGAC-3’). | |
|
|
| |
| |
| Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и ее применение. |
|
| | Первые публикации по полимеразной цепной реакции (ПЦР) появились в 1983 г. и впоследствии известный американский научно-популярный журнал “Science” назвал эту работу самым выдающимся открытием последних лет. В сравнительно короткие сроки этот метод распространился по исследовательским и диагностическим лабораториям по всему миру. ПЦР используется для проведения научных исследований и клинических диагностических исследований. Но все же наиболее широко этот метод молекулярной биологии применяется сегодня в медицине в области генодиагностики наследственных и инфекционных заболеваний. | |
|
|
| |
| |
| Эндонуклеазы рестрикции и их применение |
|
| | Системы рестрикции-модификации (Р-М системы) широко распространены среди микроорганизмов. В бактериальную Р-М систему входят два специфичных для каждого штамма фермента - ДНК модифицирующий (метилаза) и ДНК расщепляющий (эндонуклеаза рестрикции - рестриктаза). Эти два фермента способны специфически связываться с одной и той же последовательностью ДНК длиной 4-8 пар оснований, называемой сайтом узнавания и характерной для каждого конкретного микроорганизма. | |
|
|
| |
| |
| Эндонуклеаза рестрикции AjnI из Acinetobacter johnsonii R2 — изошизомер EcoRII, узнаёт 5’-↓CCWGG-3’, но не блокируется dcm-метилированием |
|
| | Из природных изолятов был выделен новый продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), идентифицированный как вид Acinetobacter johnsonii R2, а его рестриктаза названа AjnI. Описан способ очистки и оценки активности фермента. Показано, что рестриктаза AjnI образует фрагменты ДНК с 5’-CCWGG выступающими концами, как и EcoRII, но не блокируется dcm-метилированием. Рестриктаза AjnI может найти широкое применение в генетической инженерии. | |
|
|
| |
| |
| Эндонуклеазы рестрикции FalI и FalII из Flavobacterium aquatile Ob10 узнают 5'-(8/13)AAG(N)5CTT(13/8)-3' и 5'-CG↓CG-3', соответственно |
|
| | Из водных изолятов нами выделен штамм Flavobacterium aquatile Ob10, который продуцирует две эндонуклеазы рестрикции FalI и FalII. FalI является новым прототипом и узнает последовательность ДНК 5'-(8/13)AAG(N)5CTT(13/8)-3'. Фермент FalI стимулируется S-аденозилметионином и расщепляет ДНК с обеих сторон от узнаваемой последовательности. Таким образом, FalI принадлежит к BcgI-подтипу эндонуклеаз рестрикции. FalII расщепляет ДНК по сайту 5'-CG↓CG-3', являясь, таким образом, изошизомером FnuDII. | |
|
|
| |
| |
| Эндонуклеаза рестрикции Bst19 I из штамма Bacillus stearothermophilus, узнающая последовательность ДНК 5’-GCATC-3’ |
|
| | Выделен штамм Bacillus stearothermophilus 19 являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции Bst19I. Получен препарат фермента и изучены его свойства, включая его субстратную специфичность и место расщепления ДНК. Эндонуклеаза рестрикции Bst19I идентифицирована как гетерошизомер рестриктазы SfaNI, узнающий последовательность 5’-GCATC-3’ и гидролизующий ДНК на расстоянии 4 и 6 нуклеотидов от сайта узнавания на верхней и нижней цепях соответственно. | |
|
|
| |
| |
| Эндонуклеаза рестрикции FatI из Flavobacterium aquatile NL3 расщепляет ДНК по сайту 5'-^CATG - 3' |
|
| | Новый продуцент эндонуклеазы рестрикции был получен из природных изолятов и идентифицирован как вид бактерии Flavobacterium aquatile NL3, а соответствующая рестриктаза названа FatI. Описаны способ очистки и определение активности фермента. Показано, что рестриктаза FatI образует фрагменты ДНК с 5'-CATG выступающими концами и может найти широкое применение в генетической инженерии. | |
|
|
| |
| |
| Сравнительный анализ гомологичных систем рестрикции-модификации SfeI и LlaBI |
|
| | Клонирован фрагмент плазмидной ДНК Streptococcus faecalisSE72, содержащий гены системы рестрикции-модификации SfeI. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента выявил высокую гомологию между оперонами систем SfeI и LlaBI из Lactococcus lactis subsp. cremoris W56 (99.2%) с тем же участком узнавания 5-CTRYAG-3'. Существенными отличиями системы SfeI от LlaBI являются дополнительный фрагмент длиной 198 п.н. в гене ДНК-метилтрансферазы и большая длина гена предполагаемого контрольного белка. Отсутствие гомологии между нуклеотидными последовательностями, прилегающими к оперонам двух систем, свидетельствует о горизонтальном переносе оперонов между двумя близкими родами бактерий. | |
|
|
| |
| |
| Выделение и характеристика эндонуклеазы I из Proteus vulgaris 84 |
|
| | Фермент с молекулярной массой 33 кД был выделен и очищен более чем в 200 раз. Определены оптимальные условия действия фермента: pH 9,5, 25 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl. Фермент наиболее активен при 37°C. Показано, что выделенный фермент является эндонуклеазой, которая гидролизует нативную и денатурированную нагреванием ДНК и РНК до олигонуклеотидов длиной 3-5 нуклеотидных остатка с 5 -фосфатом на конце. | |
|
|
| |
| |
| Эндонуклеаза рестрикции ZraI из Zoogloea ramigera 11 узнает 5'-GAC↓GTC-3' |
|
| | Из природных изолятов нами выделен продуцент эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), идентифицированный как вид бактерии Zoogloea ramigera 11, а его рестриктаза была названа ZraI. Описан способ очистки фермента и определения его активности. Показано, что фермент ZraI расщепляет ДНК с образованием тупых концов и может найти широкое применение в генетической инженерии. | |
|
|
| |
| |
| Новая сайт-специфическая ДНК-никаза N.Bst9I из Bacillus stearothermophilus 9 |
|
| | В ходе скрининга бактериальных штаммов, выделенных из природных изолятов, нами обнаружен штамм Bacillus stearothermophilus 9, продуцирующий новую сайт-специфическую ДНК-никазу, названную N.Bst9I. N.Bst9I узнает и расщепляет в ДНК последовательность 5'-GAGTCNNNN^-3', являясь таким образом изошизомером ранее обнаруженного нами фермента N.BstSEI. Однако ферментативные свойства этих двух ферментов существенно различаются, причем использование N.Bst9I в генно-инженерных и биотехнологических работах предпочтительнее, так как он практически не проявляет дополнительную активность, характерную для N.BstSEI. | |
|
|
| |
| |
| Множественность сайт-специфических ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BstF5I из Bacillus stearothermophilus F5 |
|
| | Определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК Bacillus stearothermophilus F5, прилегающего к 3'-концу области, содержащей гены ДНК-метилтрансфераз M.BstF5I-1 и M.BstF5I-2 из системы рестрикции-модификации BstF5I. Выявлен ген, кодирующий белок M.BstF5I-3, структурно и функционально гомологичный N-концевому домену метилазы M.FokI. Таким образом, в отличие от всех известных систем рестрикции-модификации, система BstF5I включает три гена, кодирующих ДНК-метилтрансферазы, две из которых гомологичны двум различным доменам M.FokI. | |
|
|
| |
| |
| Вторая ДНК-метилтрансфераза из системы рестрикции-модификации BstF5I гомологична C-концевым доменам метилаз FokI и StsI |
|
| | Определена нуклеотидная последовательность гена ДНК-метилтрансферазы М.BstF5I-2, входящей в систему рестрикции-модификации штамма Bacillus stearothermophilus F5. На бактериальной хромосоме ген bstF5IM-2 располагается за геном метилазы М.BstF5I-1 и имеет ту же ориентацию. Кодируемый геном bstF5IM-2 белок содержит консервативные участки, специфичные для адениновых ДНК-метилтрансфераз класса D12. ДНК-метилаза М.BstF5I-2 гомологична С-концевым доменам ДНК-метилаз FokI и StsI, имеющим ту же последовательность узнавания. Таким образом, система рестрикции-модификации BstF5I содержит уникальный фермент М.BstF5I-1, модифицирующий верхнюю цепь узнаваемой последовательности, и М.BstF5I-2, гомологичный С-концевым частям ферментов-изошизомеров М.FokI и М.StsI, модифицирующих вторую цепь ДНК в участке узнавания. | |
|
|
| |
| |
| AccBSI - новая эндонуклеаза рестрикции из Acinetobacter calcoaceticus BS |
|
| | Установлен сайт узнавания новой эндонуклеазы рестрикции AccBSI из бактериального штамма Acinetobacter calcoaceticus BS, представляющий собой непалиндромную последовательность нуклеотидов
5-GAGCGG-3'
3'-CTCGCC-5'
Разрыв обеих цепей ДНК рестриктаза AccBSI производит в середине узнаваемой последовательности, поэтому лигазная сшивка образующихся фрагментов приводит как к восстановлению сайтов узнавания AccBSI, так и к образованию палиндромных последовательностей, служащих сайтами узнавания рестриктаз SacI и SacII. | |
|
|
| |
| |
| N.BstSE - сайт-специфическая никаза из Bacillus stearothermophilus SE-589 |
|
| | Из штамма Bacillus stearothermophilus SE-589 выделена сайт-специфическая никаза, узнающая и гидролизующая последовательность ДНК в указанном стрелкой положении:
5'-G-A-G-T-C-N-N-N-N^N-N-3'
3'-C-T-C-A-G-N-N-N-N-N-N-5'
Изучение свойств этого фермента, названного N.BstSE, свидетельствует о его вероятном родстве с эндонуклеазами рестрикции типа II.
| |
|
|
| |
| |
| Определение эндонуклеаз рестрикции в колониях микроорганизмов Streptomyces и Nocardia |
|
| | Предложен метод тестирования различных штаммов актиномицетов Streptomyces и Nocardia на наличие эндонуклеаз рестрикции. Тестирование проводилось непосредственно в клетках из колоний с чашки Петри. Собранные клетки обрабатывали лизоцимом и тритоном Х-100, после чего клеточный лизат анализировали на наличие специфической эндонуклеазной активности. Метод позволяет тестировать ферменты NcoI, NotI, NruI, SfiI, Sfr303I в лизатах соответствующих штаммов-продуцентов. | |
|
|
| |
| |
| Выявление штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикций среди водных микроорганизмов озера Байкал |
|
| | Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) находят широкое применение в генно-инженерных работах [1, 2], что обусловливает актуальность выявления новых штаммов-продуцентов этих ферментов, являющихся более технологичными, чем известные.
Поиск новых штаммов-продуцентов рестриктаз проводится среди микроорганизмов, выделенных из различных природных изолятов. Водные микроорганизмы относительно плохо изучены как возможные продуценты рестриктаз, хотя среди них недавно были выявлены ферменты с новой специфичностью [3, 4].
Целью данной работы явились обнаружение и идентификация новых штаммов-продуцентов рестриктаз среди микроорганизмов уникальной экологической ниши — оз. Байкал.
Изолированность экосистемы Байкала, установленная в настоящее время, обеспечивает благоприятные условия для образования новых видов организмов. Поскольку хорошо известно, что при прочих равных условиях скорость эволюции вида обратно пропорциональна продолжительности генерации [5], то очевидна целесообразность поиска эндемичных видов и, следовательно, продуцентов новых ферментов среди байкальских микроорганизмов, т. е. штаммов, выделенных из пелагиальной части водной толщи и донных отложений.
| |
|
|
| |
| |
| Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции |
|
| | Предложен метод аффинной хроматографии эндонуклеаз рестрикции IIS-типа. Показано, что рестриктазы HgaI, FokI, SfaNI избирательно связываются на носителе с иммобилизованным дуплексом (один из олигонуклеотидов которого ковалентно связан с полимерным носителем), содержащим сайты узнавания этих ферментов, но неспособным гидролизоваться ими. | |
|
|
| |
| |
| Модифицированный способ определения места расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции |
|
| | Успехи молекулярной биологии и генетической инженерии во многом определяются наличием широкого ассортимента эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз), список которых ежегодно пополняется новыми наименованиями [1]. Обнаруживаемые ферменты необходимо охарактеризовать как по узнаваемой ими последовательности, так и по месту расщепления цепи ДНК. Идентификация сайта узнавания в настоящее время не представляет проблемы. С этой целью обычно используют совместный гидролиз ДНК изучаемыми ферментами и ферментами известной специфичности [2—4] либо сравнивают экспериментальные данные с предполагаемыми картинами расщепления маркерной ДНК по сайтам узнавания [5—8]. | |
|
|
| |
| |
| Определение чистоты препаратов эндонуклеаз рестрикции |
|
| | В начале 70-х годов были открыты первые эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), а сегодня уже налажен выпуск широкого ассортимента этих ферментов для использования в генно-инженерных работах. Одной из важнейших характеристик производимых препаратов ферментов является их чистота от примесных активностей, в частности от примесей нуклеаз и фосфатаз. | |
|
|
| |
| |
| Поиск штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди почвенных микроорганизмов |
|
| | Возникновение генетической Инженерии и ее успехи в значительной мере связаны с открытием эндонуклеаз рестрикции [1], Эти ферменты широко используются в решении прикладных задач и служат объектом фундаментальных исследований, касающихся белок-нуклеиновых взаимодействий [1—3]. Наряду с этим, актуальным является изучение биосинтеза рестриктаз [4].
Целью данной работы явилось выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди почвенных микроорганизмов, а также оптимизация культивирования одного из них.
| |
|
|
| |
| |
| Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий |
|
| | Предложен метод тестирования бактериальных штаммов на наличие эндонуклеаз рестрикции. Анализ проводится непосредственно в клетках из колоний с чашки Петри. Собранные клетки обрабатывают лизоцимом и тритоном Х-100 и после центрифугирования супернатант анализируют на наличие специфической эндонуклеазной активности. Метод позволяет за 3—4 ч провести анализ до 100 колоний. | |
|
|
| |
| |
| Расщепление ДНК, адсорбированной на поверхности фосфолипидных мембран, рестриктазами типа II |
|
| | Изучен гидролиз ДНК фага λ рестриктазами типа II в присутствии модельных мембран из яичного фосфатидилхолина. Показано, что степень гидролиза ДНК ферментами BspI, PstI и BamHI в этих условиях резко снижена. Это не связано с необратимой инактивацией ферментов или их взаимодействием с мембраной. Наиболее вероятное объяснение ингибирования гидролиза ДНК в присутствии фосфолипидных везикул - изменение субстратных свойств ДНК в результате ее адсорбции на поверхности фосфолипидной мембраны при участии ионов Mg2+. | |
|
|
| |
| |
