Клонирование системы рестрикции-модификации BpuN4I из Bacillus Pumilus N4
ДНК бактериального штамма Bacillus pumilus N4, несущего систему рестрикции-модификации BpuN4I (сайт узнавания 5’-GGNNCC-3’), гидролизовалась эндонуклеазами рестрикции MfeI и EcoRI и полученные продукты клонировались в вектор pUC19, линеаризованный EcoRI. Для отбора клонов, несущих ген эндонуклеазы рестрикции BpuN4I, было предложено использовать метод селекции, основанный на делении (разведении) полученной библиотеки клонов с прямым определением активности эндонуклеазы рестрикции в суммарных лизатах клеток. С помощью данного метода был выявлен рекомбинантный штамм E. coli N41(pBpuN4/MR), являющийся продуцентом фермента BpuN4I. Также была проведена селекция полученной библиотеки традиционным методом Венецианера и получены два различных клона, один из которых идентичен E. coli N41(pBpuN4/MR), а второй, E. coli N7(pBpuN4/MR), содержит вставку в плазмиде в противоположном направлении и проявляет меньшую активность. Была установлена структура ДНК плазмидной вставки штамма E.coli N41(pBpuN4/M)R и показано, что она содержит гены ДНК-метилтрансферазы M.BpuN4I и эндонуклеазы рестрикции BpuN4I. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности ферментов, кодируемых данными генами, выявил гомологию M.BpuN4I с другими метилазами, узнающими сайт 5’-GGNNCC-3’ или сходный с ним. В аминокислотной последовательности M.BpuN4I выявлены все домены, характерные для 5мС-ДНК-метилтрансфераз.
Читать полный текст статьи Клонирование системы рестрикции-модификации BpuN4I из Bacillus Pumilus N4
MteI-ПЦР анализ – новый метод определения статуса метилирования GC-богатых регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека
Предложен новый метод MteI-ПЦР-анализа GC-богатых участков ДНК, основанный на уникальной метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазе MteI, имеющей протяженный высокометилированный сайт узнавания. Метод включает гидролиз ДНК ферментом MteI с последующим проведением ПЦР либо в реальном времени, либо с определением полученных продуктов метод гель-электрофореза. Установлен статус метилирования регуляторных участков ряда генов-онкосупрессоров методом MteI-ПЦР-анализа в сравнении с ранее предложенным методом BlsI- и GlaI-ПЦР-анализа. Показана применимость метода MteI-ПЦР-анализа для анализа статуса метилирования регуляторных участков генов CEBPD, HS3ST2, RASSF1A, SEPT9b и TWIST1. В случае гена RASSF1A real-time MteI-ПЦР анализ, в отличие от real-time GlaI- и BlsI-ПЦР анализа, не показывает метилирования данного участка ДНК в контрольных здоровых клетках линии фибробластов легких. Таким образом, MteI-ПЦР анализ позволяет более четко определять и дискриминировать статус метилирования регуляторного участка гена RASSF1A и, вероятно, других GC-богатых участков ДНК человека.
Новая сайт-специфическая эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнает и расщепляет последовательность ДНК 5’-G^GNNCC-3’
Из бактериального штамм Bacillus pumilus N4 выделена новая эндонуклеаза рестрикции BpuN4I, определена ее субстратная специфичность и место расщепления ДНК. Эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнает последовательность ДНК 5’-G↓GNNCC-3’ и расщепляет ее как указано стрелкой. Фермент, расщепляющий сайт 5’-GGNNCC-3’ с образованием четырехнуклеотидных 5'-липких концов, обнаружен впервые. Рестриктаза BpuN4I является неошизомером фермента NlaIV, имеющего такую же последовательность узнавания, но образующего фрагменты ДНК с тупыми концами.
Самые читаемые
Последние материалы
- GlaI-ПЦР-анализ в режиме реального времени регуляторных областей генов HDAC4, RARB and URB1 человека
- Применение метода GLAD-ПЦР анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ELMO1 и ESR1 при колоректальном раке
- Клонирование системы рестрикции-модификации BpuN4I из Bacillus Pumilus N4
- MteI-ПЦР анализ – новый метод определения статуса метилирования GC-богатых регуляторных участков генов-онкосупрессоров человека
- Новая сайт-специфическая эндонуклеаза рестрикции BpuN4I узнает и расщепляет последовательность ДНК 5’-G^GNNCC-3’